CRISPR technologie

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) – clustery pravidelně rozmístěných krátkých palindromických repetic jsou úseky prokaryotické DNA, obsahující krátké repetice nukleotidů. Každou z repetic následují krátké segmenty tzv. spacer DNA, ziskanými při předchozích setkáních s příslušnými bakteriálními viry nebo plastidy.(1)

CRISPR/Cas systém je prokaryotický imunitní systém, který zajišťuje rezistenci vůči cizím genetickým elementům, jako jsou plastidy nebo fágy, a představuje tedy formu získané imunity. Spacerová DNA tyto exogenní genetické elementy rozpozná a deaktivuje způsobem analogickým s mechanismem RNA interference v eukaryotických organismech. (Obrázek 1)(1)

Potenciál využití technologie CRISPR

CRISPR lokusy již byly objeveny u přibližně 40 % osekvenovaných bakterií a u 90 % archeí. Technologie CRISPR má velký potenciál pro uplatnění v různých oblastech molekulární genetiky, včetně pozměňování zárodečné linie lidí, hospodářských zvířat i dalších organismů nebo modifikace genů potravinářských plodin. Doručením proteinu Cas9 a příslušné naváděcí RNA do buňky lze genom cílového organismu rozstřihnout v jakémkoliv požadovaném místě. CRISPR ve spojení se specifickými endonukleázami, určenými k editování genomu nebo k cílené regulaci genů, byly již testované v různých organismech. (1)

Mechanismus působení CRISPR

V bakteriích se CRISPR skládají z řady repetic, oddělených segmenty exogenní DNA (~ 30 bp), tzv. mezerníky (spacery). Repetice-spacerové úseky jsou přepisované jako dlouhý prekurzor a jsou zpracovány na malé crRNAs, určující cílové sekvenace (také známé jako protospacery), a ty jsou štěpené Cas9 proteinem, což je nukleáza v CRISPR systému. CRISPR spacery jsou pak použité k rozpoznání a umlčení exogenních genetických elementů na úrovní DNA.

Pro štěpení je nezbytný tři-nukleotidový sekvenční motiv (NGG) bezprostředně po proudu na konci 3cílové oblasti. Známý je jako protospacer-sousedící motiv (PAM). PAM je přítomný v cílové DNA, ale nikoliv v crRNA, která ji rozpoznává. (Obrázek 2) Po vazbě k cílové sekvenaci Cas9 protein indikuje specifický dvouvláknový zlom. Následuje štěpení DNA, zlom je opraven prostřednictvím buněčných reparačních mechanismů, jako je nehomoloví spojování konců (NHEJ) nebo homologií řízená oprava (HDR). (Obrázek 2) (2)

Systém CRISPR-Cas9 se skládá z krátké nekódující navádějící RNA (gRNA), která má dvě molekulární složky: cílově specifickou CRUSPR RNA (crRNA) a pomocnou trans-aktivační crRNA (trancrRNA). Jednotka gRNA navede Cas9 protein na specifický genomový lokus pomocí párování bází mezi sekvenací crRNA a cílovou sekvenací. (2)

Hlavní komponenty CRISPR Cas9 systému (1)

• crRNA – obsahuje naváděcí RNA (guide RNA), lokalizující správný úsek DNA hostitele spolu s oblastí, která se váže k tracrRNA (obvykle ve formě vlásenky) a vytváří aktivní komplex
• tracrRNA – váže se s crRNA a tvoří aktivní komplex
• sgRNA – jednotlivé naváděcí RNA jsou kombinované RNA složené z tracrRNA a alespoň jedné crRNA
• Cas9 – protein jehož aktivní forma je schopna modifikovat DNA, existuje mnoho variant s rozdílnými funkcemi (tj. jednovláknové zlomy, dvouvláknové zlomy, vazba DNA), díky funkci rozpoznávací místo DNA Cas9 je.
• Templát opravy – DNA která vede buněčný proces opravy umožňující vložení specifické sekvenace DNA

Sekvenace Cas9 a její použití

CRISPR/Cas9 často používá plazmidy pro transfekci cílových buněk. Pro vnášení Cas9 a gRNA do cílových buněk se mohou použít virové nebo nevirové systémy. Elektroporace DNA, RNA nebo ribonukleokomplexy jsou nejběžnější a nejlevnější systémy. Nicméně, těžko transfekovatelné buňky (kmenové buňky, neurony, hematopoetické buňky atd.) vyžadují účinnější transfekční systémy, jako jsou ty na bázi lentivirů (LV), adenovirů (ADV) a adeno-asociovaných virů (AAV).

CrRNA musí být navrhnutá a optimalizovaná pro každou aplikaci. Jde o sekvenaci, kterou Cas9 používá k identifikaci a pro přímou vazbu na DNA buňky. CrRNA se musí vázat pouze tam, kde je žádoucí editace. Templát opravy se musí překrývat se sekvenacemi na obou stranách štěpení a kódovat sekvenaci pro vložení.

Aplikace

Editace

Editaci genomu můžete provádět s CRISPR systémem typu II. Například CRISPR byly již použité ke štěpení 5-62 genů najednou. V prasečích buňkách bylo inaktivováno všech 62 prasečích endogenních retrovirů v genomu. To eliminovalo přenos infekce z prasete na lidské buňky v kultuře.

Inhibice/aktivace (CRISPR interference)

Použití „mrtvé“ verze Cas9 (dCas9) eliminuje schopnost CRISPR štěpit DNA, a to při zachování jeho schopnosti zacílit požadovanou sekvenaci. Několik vědeckých skupin přidalo různé regulační faktory k dCAS9S. To jim umožnilo zapnout nebo vypnout téměř každý gen nebo nastavit úroveň jeho aktivity. Stejně jako RNAi, CRISPR interference (CRISPRi) inhibuje geny reverzním způsobem, a to zacílením sekvenace, nikoliv štěpením. Cílové místo se styluje e epigeneticky se modifikuje na cílový gen.

Tato modifikace inhibuje transkripci. Cas9 je efektivní způsob zacílení a umlčení specifických genů na úrovni DNA. V bakteriích je přítomnost samotného Cas9 pro inhibici transkripce dostatečná. U aplikací v savčích buňkách se přidává část proteinu. Jeho naváděcí RNA rozpoznává regulační DNA sekvenace zvané promotory, které bezprostředně předcházejí cílovému genu. Cas9 se používá také jako nosič pro syntetické transkripční faktory, které aktivují specifické lidské geny.

Modelové organismy

CRISPR technologie zjednodušuje tvorbu modelových organismů pro výzkumné účely, které napodobují onemocnění nebo nesou fenotypové znaky způsobené utlumením fenu či jeho mutací. CRISPR můžete použít na úrovni zárodečné linie pro vytvoření organismů se změněným genem ve všech buňkách nebo jej můžete zaměřit jen na nezárodečné linie buněk. CRISPR byl již aplikován na lidské pluripotentní kmenové buňky a byly do nich zavedené cílené mutace v genech pro syndrom polycystického onemocnění ledvin (PKD) a fokální segmentovou glomerulosklerózu (FSG).

Biomedicína

V biomedicíně můžete CRISPR/Cas nukleázy použít k zacílení virulentních faktorů, genů kódujících rezistenci na antibiotika a dalších lékařsky relevantních genů. Tato technologie tak představuje novou formy antimikrobiální terapie a strategie, kterou lze manipulovat bakteriální populace. Dosavadní výsledky ukazují, že CRISPR je účinný způsob, jak omezit replikaci herpetických virů, jak odstranit DNA viru Epstein-Barrové (EBV). Anti-herpesvirus CRISPRs mají několik slibných aplikací, jako je odstranění rakovinotvorného EBV z nádorových buněk.

In vitro genetická deplece

Neobohacené sekvenční knihovny mají řadu nežádoucích sekvenací. Cas9 umí specificky depletovat nežádoucí sekvenace dvouvláknovým zlomem s až 99% účinností a bez výrazných off-target účinků, které jsou časté u restrikčních enzymů. Například použití Cas9 může vyčerpat bohaté rRNA při současném zvýšení citlivosti patogenů v RNA-seq knihovnách.