Předchozí metody sekvenování umožňovaly rozpoznat rozdíly v genomu pouze u komplexní směsi buněk, což mohlo často vést k překrytí heterogenity u jednotlivých buněk. Díky novým revolučním metodám: systému MDA (Multiple Displacement Amplification) a NGS sekvenace lze nyní analyzovat i genomy jedné buňky. Tyto procesy lze využít v celé řadě aplikací, zejména při profilování vzácných klinických vzorků, preimplantační genetickou diagnostiku (PGD), měření heterogenity v rámci nádoru a vedení chemoterapie a v neposlední řadě také sledování vývoje rakovinné buňky.
| umožní stejnorodou a nezkreslenou amplifikaci celého genomu | velmi vysoká kvalita a přesnost sekvenace, minimální chybovost |
| je zapotřebí pouze malé vstupní množství DNA (z jedné nebo více buněk) | molekulová hmotnost DNA > 10 kb, umožní lepší detekci SV a CNV |
Jednotlivé buňky jsou náhodně izolovány z krve nebo tkáně do PCR zkumavek za pomoci inverzního mikroskopu a mikrokapilárního pipetovacího systému.
Je nutné potvrdit, zda byla izolace úspěšná. Buňky je nutné 3x promýt pomocí elučního pufru. WGA buněk je prováděna s kitem REPLI-g (dle instrukcí).
Koncentraci amplifikované DNA je nutno změřit pomocí Quant-iTassays. Genovaná integrita vhodných produktů je dále analyzována pomocí PCR amplifikace 8 'housekeeping' genů. Ty reprezentují osm genů lokalizovaných na osmi různých chromozomech. Vybrané WGA produkty s nejlepšími parametry (PCR 'houseekping" genů ≥ 6/8, Qubit > 60 ng/ml) se použijí pro další experimenty.
Následuje navržení strategie konstrukce knihovny (totožná jako při resekvenování) a navržení strategie sekvenování (91PE nebo 101PE).
Při bioinformatické analýze jsou získána příslušná výstupní data, která lze rovněž označit za hrubá data (uložena ve fastq formátu).
Ukázka vstupních sekvenačních dat z bioinformatické analýzy
Po získání výstupních dat následuje jejich QC sekvenace, která spočívá ve znečištění adaptérů a čtení obsahujícím N báze a další. Nashromážděná data je zapotřebí dále vyfiltrovat. Odstraní se čtení, jež obsahují pouze adaptér, dále ta, jejichž poměř N přesahuje 10 % a ta, která obsahují více než 50 % bází s nízkou kvalitou.
