V dalším díle naší kuchařky vám přinášíme podrobný popis sekvenace jedné buňky. Dozvíte se základní informace o jednotlivých fázích tohoto procesu (od izolace buňky až po bioinformatickou analýzu), přiblížíme vám výhody metody MDA a seznámíme vás se základními požadavky na odběr a skladování vzorků.
MDA metoda umožní sledovat vývoj rakovinné buňky během progrese nádoru
Předchozí metody sekvenování umožňovaly rozpoznat rozdíly v genomu pouze u komplexní směsi buněk, což mohlo často vést k překrytí heterogenity u jednotlivých buněk. Díky novým revolučním metodám: systému MDA (Multiple Displacement Amplification) a NGS sekvenace lze nyní analyzovat i genomy jedné buňky. Tyto procesy lze využít v celé řadě aplikací, zejména při profilování vzácných klinických vzorků, preimplantační genetickou diagnostiku (PGD), měření heterogenity v rámci nádoru a vedení chemoterapie a v neposlední řadě také sledování vývoje rakovinné buňky.
| umožní stejnorodou a nezkreslenou amplifikaci celého genomu | velmi vysoká kvalita a přesnost sekvenace, minimální chybovost |
| je zapotřebí pouze malé vstupní množství DNA (z jedné nebo více buněk) | molekulová hmotnost DNA > 10 kb, umožní lepší detekci SV a CNV |
Jak se provádí sekvenace genomu z jedné buňky
1) Izolace buňky
Jednotlivé buňky jsou náhodně izolovány z krve nebo tkáně do PCR zkumavek za pomoci inverzního mikroskopu a mikrokapilárního pipetovacího systému.
2) Lýze a celogenomová amplifikace
Je nutné potvrdit, zda byla izolace úspěšná. Buňky je nutné 3x promýt pomocí elučního pufru. WGA buněk je prováděna s kitem REPLI-g (dle instrukcí).
3) Určení kvantity a genomové integrity WGA
Koncentraci amplifikované DNA je nutno změřit pomocí Quant-iTassays. Genovaná integrita vhodných produktů je dále analyzována pomocí PCR amplifikace 8 'housekeeping' genů. Ty reprezentují osm genů lokalizovaných na osmi různých chromozomech. Vybrané WGA produkty s nejlepšími parametry (PCR 'houseekping" genů ≥ 6/8, Qubit > 60 ng/ml) se použijí pro další experimenty.
4) Sekvenace
Následuje navržení strategie konstrukce knihovny (totožná jako při resekvenování) a navržení strategie sekvenování (91PE nebo 101PE).
5) Bioinformatická analýza
Při bioinformatické analýze jsou získána příslušná výstupní data, která lze rovněž označit za hrubá data (uložena ve fastq formátu).
Ukázka vstupních sekvenačních dat z bioinformatické analýzy
Po získání výstupních dat následuje jejich QC sekvenace, která spočívá ve znečištění adaptérů a čtení obsahujícím N báze a další. Nashromážděná data je zapotřebí dále vyfiltrovat. Odstraní se čtení, jež obsahují pouze adaptér, dále ta, jejichž poměř N přesahuje 10 % a ta, která obsahují více než 50 % bází s nízkou kvalitou.
Doba sekvenace jedné buňky včetně bioinfromatické analýzy se obvykle pohybuje kolem 50 dní. Pro více informací o sekvenaci jedné buňky nás kontaktujte.
Standardní bioinformatická analýza zahrnuje:
- filtrování dat (odstranění kontaminace adaptéry a nekvalitních čtení z hrubých dat)
- přiřazení, souhrn dat
- SNP anotace a statistika
- InDEL anotace a statistika
- CNV anotace a statistika (pouze pro WGS)
- SV anotace a statistika (pouze pro WGS)
- GO analýza a analýza signálních drah u vybraných genů
Při ODBĚRU vzorků se řiďte následujícími pokyny:
- Záznam o vzorku musí být kompletní. Záznam by měl obsahovat čas odběru, místo, osobu provádějící odběr, typ vzorku a detaily o zpracování. Každý vzorek musí mít jedinečné ID.
- Vyhněte se kontaminaci mezi vzorky a kontaminaci z vnějšího prostředí.
- Pokud se jedná o rozsáhlou nádorovou tkáň, předpokládá se, že jednotlivé odebrané části jsou odvozeny od primárního nádoru (např. nádory centrálních a periferních tkání). Každá část by měla být větší než 0,5 cm3 a jednotlivé části by měly být zabaleny a označeny odděleně.
Při SKLADOVÁNÍ vzorků se řiďte následujícími pokyny:
- Tkáňové vzorky by měly být okamžitě uloženy do kapalného dusíku nebo při teplotě - 80 ℃ po chirurgické resekci bez dalšího pronikání činidel. U vzorků fixovaných ve formalínu a zalitých do parafínu nelze provádět sekvenování jedné buňky.
- Vzorky plné krve (nebo kostní dřeně) se odebírají do antikoagulačních zkumavek a skladují se při - 80 ℃. Celkový objem vzorku nesmí být menší než 5 ml.
- Buněčné suspenze nebo buněčné linie by měly být zpracovány podle standardního protokolu, postupně zmrazeny v mrazícím médiu a skladovány v kapalném dusíku nebo při - 80 ℃.
- U solidních nádorů se doporučuje velikost je 1 - 2 cm3 (větší vzorek není vhodný pro zmrazení a menší vzorek neposkytuje dostatečné množství materiálu pro experimenty). U některých vzácně se vyskytujících nádorů není velikost menší než 5 mm3.
Upozornění! U jednotlivých vzorků by se nemělo provádět opakované zmrazování a rozmrazování. Pokud použijete speciální metody rozmrazení či ochranná činidla, vždy sdělte jejich přesnou specifikaci.
Při TRANSPORTU vzorků se řiďte následujícími pokyny:
- Vzorky by měly být dobře zabaleny do čistých pytlíků nebo zkumavek a skladovány na suchém ledu (obvykle 10 kg suchého ledu pro dobu tří dnů).
- Kontejnery se suchým ledem by měly být vyplněny měkkým nebo pružným materiálem kolem zkumavek a co nejdříve zaslány do příslušné firmy, která provede sekvenaci.
- Pečlivě označte zkumavky/pytlíky a poskytněte podrobné informace o vzorku: původ, sériové číslo, čas odběru vzorku, atd.