Připravili jsme pro vás pracovní protokol pro použití GeneRuler 50 bp DNA Ladder. Jedná se o postup pro dimenzování a přibližnou kvantifikaci širokého spektra dvouřetězcové DNA v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu. Žebříček se skládá ze třinácti individuálně chromatograficky čištěných fragmentů (v párech bází) 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50. Pro jednoduchou orientaci obsahuje dva referenční proužky (500 a 250 bp). Žebříček je rozpuštěn v TE pufru.
Specifikace GeneRuler 50 bp DNA Ladder
| Skladovací pufr 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1 mM EDTA |
6X DNA Loading Dye 10 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.03% bromophenol blue 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol and 60 mM EDTA |
Certifikáty analýz
- Dobře definované proužky jsou formovány během elektroforézy na agarózovém gelu.
- DNA koncentrace se určuje spektofometricky.
- Nepřítomnost nukleázy je potvrzená přímým nukleázovým testem.
| Složky | Gely | |
|---|---|---|
| Agarózový | Polyakrylamidový | |
| DNA Ladder (0,5-1µg) | 1-2µL | 1-2µL |
| 6x DNA Loading Dye | 1µL | 0.5µL |
| Deionizovaná voda | 4-3µL | 1.5-0.5µL |
| Celkové množství | 6µL | 3µL |
ROK 1: Promíchejte jemně všechny složky
KROK 2: Naneste na gel
Protože je kvalita proužků závislá na velikosti a tvaru studniček, je vhodné tomu přizpůsobit nanášku.
Doporučení, jak postupovat při dimenzování a kvantifikaci DNA
- Před nanesením nevařte.
- Nařeďte vzorek DNA 6X DNA Loading Dye (#R0611, supplied with the ladder): smíchejte 1 objem barvícího roztoku dye roztoku s 5 objem DNA vzorku.
- Nanášejte stejné objemy DNA vzorku i DNA žebříčku.
- Pro kvantifikaci - přizpůsobte koncentraci vzorku aby odpovídal koncentraci nejbližšího proužku.
- Nepřidávejte barvičku do vzorku, ale obarvěte gel po elfu, nebo přidejte barvičku do gelu, jinak můžete ovlivnit odlišný průběh migrace.