Informujte se o vlastnostech, přednostech a možnostech aplikací enzymů pro in vitro transkripci. Enzymy, které by nejlépe vyhovovaly vašim potřebám a projektům můžete zakoupit v našem eshopu BIOGEN.
SP6 RNA polymeráza
Thermo Scientific bakteriofágní SP6 RNA polymeráza je DNA - dependentní RNA polymeráza s vysokou specifitou pro svůj dvouřetězcový promotor. Enzym katalyzuje 5' → 3' syntézu RNA buď na jednovláknové, nebo dvouvláknové DNA ve směru syntézy od svého promotoru a je schopen zařadit do RNA modifikované nukleotidy.
Přednosti
- Inkorporuje modifikované nukleotidy (například aminoallyl-, biotin-, fluorescein-, digoxigenin- značené nukleotidy)
Aplikace
- Syntéza neznačené a značené RNA, která může být použita:
- pro hybridizaci, in vitro RNA translaci;
- jako aRNA, siRNA, substrát při ochraně před RNázami, templát při sekvenování genomové DNA;
- ve studiích sekundární struktury RNA, RNA-proteinových interakcí a RNA sestřihu.
Konsensus sekvence promotoru:
SP6 ATTTAGGTGACACTATAGAAGNG
Podtržená pozice (+1) představuje první nukleotid inkorporovaný do RNA během transkripce. Pouze báze v této pozici a až do +3 jsou kritické pro transkripci a musí to být G respektive purinová báze.
T3 RNA polymeráza
Thermo Scientific bakteriofágní T3 RNA polymeráza je DNA - dependentní RNA polymeráza s vysokou specifitou pro svůj dvouřetězcový promotor. Enzym katalyzuje 5' => 3' syntézu RNA buď na jednovláknové, nebo dvouvláknové DNA ve směru syntézy od svého promotoru.
Přednosti
- Inkorporuje modifikované nukleotidy (například aminoallyl-, biotin-, fluorescein-, digoxigenin- značené nukleotidy)
Aplikace
- Syntéza neznačené a značené RNA, která může být použita:
- pro hybridizaci, in vitro RNA translaci;
- jako aRNA, siRNA, substrát při ochraně před RNázami, templát při sekvenování genomové DNA;
- ve studiích sekundární struktury RNA, RNA-proteinových interakcí a RNA sestřihu.
Konsensus sekvence promotoru:
T3 AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA
Podtržená pozice (+1) představuje první nukleotid inkorporovaný do RNA během transkripce. Pouze báze v této pozici a až do +3 jsou kritické pro transkripci a musí to být G respektive purinová báze.
T7 RNA polymeráza
Thermo Scientific bakteriofágní T7 RNA polymeráza je DNA - dependentní RNA polymeráza s vysokou specifitou pro svůj dvouřetězcový promotor. Enzym katalyzuje 5' → 3' syntézu RNA buď na jednovláknové, nebo dvouvláknové DNA ve směru syntézy od svého promotoru.
Přednosti
- Inkorporuje modifikované nukleotidy (například aminoallyl-, biotin-, fluorescein-, digoxigenin- značené nukleotidy)
Aplikace
- Syntéza neznačené a značené RNA, která může být použita:
- pro hybridizaci, in vitro RNA translaci;
- jako aRNA, siRNA, substrát při ochraně před RNázami, templát při sekvenování genomové DNA;
- ve studiích sekundární struktury RNA, RNA-proteinových interakcí a RNA sestřihu.
Konsensus sekvence promotoru:
T7 TAATACGACTCACTATAGGGAGA
Podtržená pozice (+1) představuje první nukleotid inkorporovaný do RNA během transkripce. Pouze báze v této pozici a až do +3 jsou kritické pro transkripci a musí to být G respektive purinová báze.
DNáza I
Thermo Scientific DNáza I (bez RNáz) je endonukleáza štěpící jednořetězcovou nebo dvouřetězcovou DNA. Enzym hydrolyzuje fosfodiesterové vazby za vzniku mono - a oligodeoxyribonukleotidů s 5' – fosfátovou a 3' - OH skupinovou.
Enzymová aktivita je striktně závislá na Ca2+ a je aktivována Mg2+ nebo Mn2+ ionty.
- V přítomnosti Mg2+ štěpí DNáza I oba řetězce dsDNA a to nezávisle a náhodným způsobem.
- V přítomnosti Mn2+ enzym štěpí oba řetězce DNA na přibližně stejném místě za vzniku DNA fragmentů s tupými konci nebo s přesahujícími konci o délce jednoho nebo dvou nukleotidů.
Přednosti
- Rekombinantní enzym.
- Purifikace z hostitele neživočišného původu s nízkou úrovní RNáz.
Poznámka:
DNáza I je citlivá na fyzikální denaturaci. Míchejte ji jemně převracením zkumavky. Nevortexujte.
Aplikace
- Příprava RNA bez DNA.
- Odstranění templátové DNA po in vitro transkripci.
- Příprava DNA bez RNA před RT-PCR a RT-qPCR.
- Značení DNA metodou nick - translace ve spojení s DNA polymerázou I.
- Studie DNA - proteinových interakcí pomocí DNázy I, RNase - free footprinting.
- Tvorba knihovny náhodně překrývajících se DNA insertů. Používá se reakční pufr obsahující Mn2+.
Agaráza
Agaráza specificky štěpí polysacharidové jádro agarózy na neoagaro - oligosacharidy. Agaráza umožňuje jemnou a účinnou regeneraci DNA nebo RNA fragmentů z agarózy s nízkým bodem tání. Získané nukleové kyseliny mohou být přímo použity pro amplifikaci, klonování, sekvenování, atd.
Přednosti
- Šetrné obnovení intaktní DNA a RNA.
- Vysoký výtěžek regenerace, > 90 % výchozí DNA získané po extrakci.
- Ideální pro dlouhé (> 30 kb) i krátké (< 100 bp) DNA fragmenty.
- Aktivní v pufrech TAE a TBE.
Aplikace
- Kvantitativní regenerace DNA nebo RNA z agarózového gelu s nízkým bodem tání (LM).
Poznámky:
- Inkubujte při 42 °C.
- Konvenční agarózy nejsou vhodné pro štěpení agarázou.
- Aktivita agarázy v různých pufrů (ve srovnání s aktivitou v testovacím pufru 1x TBE):
- 1x TBE (90 mM Tris - borát, 2 mM EDTA, pH 8,3) - 100 %
- 1x TAE (40 mM Tris - acetát, 1 mM EDTA, pH 8,5) - 120 %
- 1x TPE (90 mM Tris - fosfát, 2 mM EDTA, pH 7,7) - 120 %
- 1x Bis - Tris (50 mM Bis - Tris - HCl, 1 mM EDTA, pH 6,5) - 150 %
Pyrofosfatáza, anorganická z kvasinek
Thermo Scientific Pyrofosfatáza (anorganická z kvasinek) katalyzuje hydrolýzu anorganického pyrofosfátu na dva orthofosfáty. Enzym vyžaduje dvojmocné kationty kovů s Mg2+ a za těchto podmínek má nejvyšší aktivitu.
Přednosti
- Aktivní v Thermo Scientific pufrech pro DNA polymerázy, RNA polymerázy a reverzní transkriptázy
Aplikace
- Vysoké výtěžky při syntéze RNA pomocí in vitro transkripce.
- DNA polymerační reakce: prevence akumulace pyrofosfátu.
- Odstranění kontaminantů PPi v roztocích používaných pro SNP genotypizaci pomocí metod založených na detekci pyrofosfátu.
Poznámka:
Enzym může být zředěn v dodávaném skladovacím (ředícím) pufru. Použití tohoto enzymu v některých aplikacích může být chráněno patentem a může vyžadovat licenci.
T4 RNA Ligáza
Thermo Scientific T4 RNA Ligáza katalyzuje ATP - dependentní intra - a intermolekulární tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi konci jednovláknové RNA a DNA a to spojením konců s 5' - fosfátem a 3' - hydroxylovou skupinou. Minimální substrát je nukleosid 3', 5' - bifosfát při intermolekulární reakci a oligonukleotid o délce 8 bazí při intramolekulární reakci.
Aplikace
- 3'-koncové značení RNA s cytidin 3', 5'-bis [alfa-32P] fosfátem.
- Připojení RNA k RNA .
- Syntéza oligoribonukleotidů a oligodeoxyribonukleotidů .
- Specifická modifikace tRNA .
- Ligace oligodeoxyribonukleotidu k jednovláknové cDNA při 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends).
- Místně specifická syntéza kompozitních primerů pro PCR.
Poznámka:
Enzym může být zředěn v dodávaném skladovacím (ředícím) pufru. Použití tohoto enzymu v některých aplikacích může být chráněno patentem a může vyžadovat licenci.
RiboLock RNase Inhibitor
Thermo Scientific RiboLock RNase Inhibitor inhibuje aktivitu RNázy A, B a C a to vazbou na ně v nekompetitivním stavu v poměru 1:1. Inhibitor neblokuje eukaryotické RNázy T1, T2, U1, U2, CL3 a prokaryotické RNázy I a H.
Přednosti
- Funguje v širokém rozmezí reakčních podmínek.
- Chrání RNA před degradací při teplotách do 55 °C.
Poznámka:
DTT je dodáván ve skladovacím pufru, což zajišťuje jeho stabilitu během dlouhodobého skladování, ale není nutné pro aktivitu inhibitoru. Doporučená koncentrace je 1U /ul reakční směsi.