Přečtěte si o 3 produktových řadách služby GATCLIQUID.
Hledaný výraz musí mít více jak 2 znaky.
Přečtěte si o 3 produktových řadách služby GATCLIQUID.
Neinvazivní analýzy cirkulující nádorové DNA (ctDNA) a cirkulujících nádorových buněk (CTC) z krevních vzorků, tzv. tekutá biopsie, v poslední době získávají značnou pozornost v klinické oblasti. Popis cirkulující bezbuněčné DNA není zcela nový a první zmínky lze objevit již v roce 1948, kdy Mandel a Métais popsali extracelulární nukleové kyseliny v krevním oběhu. Avšak až v roce 1970 se vědci začali zajímat o cirkulující bezbuněčnou DNA v souvislosti s nádory a bylo popsáno zvýšené množství DNA v séru pacientů s rakovinou. Přesto, buněčný původ této ctDNA byl nejasný.
V roce 1994 dvě pracovní skupiny nezávisle na sobě publikovaly výsledky týkající se detekce mutací asociovaných s nádorem v DNA z plazmy od pacientů s nádorovým onemocněním, a tak prokázaly, že nádorové buňky mohou uvolňovat DNA do oběhu. Od té doby zájem o detekci a analýzu ctDNA prudce vzrostl a to nejen za účelem detekce nádorů, ale také pro sledování účinnosti terapie a pro včasné zachycení rezistence na léky.
Výzkum ctDNA se dotkl mnoha oblastí klinického výzkumu, včetně:
Avšak sledování ctDNA skýtá i určitá úskalí jako:
Právě firma GATC Biotech se v posledních letech intenzivně věnovala optimalizaci metod pro komplexní analýzu ctDNA. V roce 2012, LifeCodexx (sesterská společnost GATC) úspěšně dokončila klinickou studii o neinvazivním prenatálním vyšetření trizomie 21 a byla to první evropská firma, která aplikovala tuto novou testovací metodu.
Kromě toho v rámci veřejně financovaných projektů a s několika klinickými partnery si GATC rozšířila své dovednosti s ctDNA v oblasti onkologie. Díky desítkám tisíc DNA extrakci z plazmy s následným sekvenováním nové generace (NGS), GATC získala velké zkušenosti v analýzách ctDNA. Získané zkušenosti firma zúročila při vytvoření služby GATCLIQUID produktové řady, která zahrnuje:
Pouhé 4 ml plazmy a používání validovaných pracovních postupů (Obrázek 1) při analýze ctDNA může poskytnout odpovědi na obtížné vědecké otázky.
Vynikající citlivost a specifita umožňují GATCLIQUID detekovat nádorovou DNA přítomnou ve velmi nízkých množstvích. Ve srovnání s konvenční tkáňovou biopsií, tekutá biopsie poskytuje minimální klinická rizika a zatížení pacientů s nádorem. Analýza ctDNA řeší problémy týkající se dostupnosti a heterogenity nádorů, které často vedou k neúčinné tkáňové biopsii. Jelikož ctDNA často pochází z rezidentních umírajících nádorových buněk, je možné detekovat nádorovou zátěž ještě předtím, než metastatické nádorové buňky vstoupí do krevního řečiště. Níže je uveden podrobný popis GATCLIQUID metody, včetně pracovních postupů a výhod příslušných analýz.
Vlastnosti bezbuněčné DNA jsou zcela odlišné ve srovnání s genomovou DNA z tkání a při její extrakci je třeba dodržovat speciální protokoly. Bezbuněčná DNA je přítomna pouze ve velmi nízkých množstvích, je fragmentovaná a obsahuje málo nebo žádnou DNA s vysokou molekulovou hmotností. Buněčná DNA je obalena nukleozómy a není tak přístupná nukleázám, proto je DNA většinou štěpena mezi nukleozómy, což vede ke vzniku charakteristických multimerů o délce ~ 150 bp (Obrázek 2). Tato distribuce velikostí připomíná oligonukleozomální žebříček apoptotických buněk.
Plazmu z EDTA zkumavek byste měli připravit rychle do 1 hodiny od odběru krve a okamžitě zmrazit, abyste zabránili zředění bezbuněčné DNA s DNA z lyzovaných krevních buněk (Obrázek 3).
Alternativně specializované sběrné zkumavky pro krev mohou být použity pro stabilizaci bezbuněčné DNA na několik dní. Kromě plazmy, můžete použít pro analýzu bezbuněčné DNA i sérum, ale to je více citlivé na lýzu bílých krvinek, což vede ke zředění bezbuněčné DNA a snížení citlivosti. Z tohoto důvodu, GATC doporučuje používat plazmu oproti séru pro analýzu ctDNA. Pro maximální kvalitu bezbuněčné DNA má GATC optimalizovaný protokol pro přípravu plazmy s přídavným krokem centrifugace pro odstranění všech buněčných stop, což umožnilo úspěšnou přípravu tisíců vzorků. Krátký protokol pro přípravu plazmy je vidět na obrázku 1 dole.
ONCOEXOME je plně automatizovaný vysokokapacitní postup pro obohacení exomu, který umožňuje vědcům objevit somatické nádorové mutace v ctDNA pomocí sekvenování nové generace.
Sekvenování zahrnuje přibližně 120 Mio párových čtení, což vede k pokrytí 120× a více u většiny vzorků. ONCOEXOME dosahuje citlivosti až 5 % a nabízí vysoký výkon v detekci mutací u pacientů s rakovinou (Obrázek 4, 5). Vzhledem k nezkreslené analýze celé kódující oblasti, je možné detekovat nové, stejně jako známé, nádorové mutace (např. mutace anotované v COSMIC databázi) v rámci analyzované ctDNA.
Zatímco tkáňová biopsie často představuje jen malou frakci nádoru, tekutá biopsie na bázi ONCOEXOME může poskytnout ucelený obraz o genetické heterogenitě nádoru. Na obrázku 4 jsme porovnali somatické mutace nalezené v nádorové tkáni pacientů s rakovinou se somatickými mutacemi detekovanými v odpovídající ctDNA ze stejných pacientů.
Vysoký podíl mutací je shodný pro nádorové a ctDNA vzorky (23 až 45 %). Ve dvou případech (rakovina jater a slinivky břišní), ještě více mutací bylo nalezeno v ctDNA než v odpovídající nádorové tkáni pacientů. Jak je znázorněno na obrázku 5, frekvence mutací mezi nádorovou tkání a plazmatickou ctDNA vykazují vysokou korelaci.
ONCOPANEL je komplexní nádorový panel pro profilování významných nádorových mutací. Pomocí PCR z jedné molekuly, která amplifikuje DNA na miliony kopií, může být ve srovnání s konvenčními PCR přístupy citlivost významně zvýšena. Metoda je optimalizována pro velmi nízké množství DNA a vysoce fragmentovanou DNA, což vede k nezaujatému obohacení široké škály relevantních nádorových cílů a zajištuje účinné zachycení heterogenity nádoru. Panel obsahuje informace o 200 amplikonech v 50 známých genech, které jsou asociovány s nádory, včetně nejdůležitějších nádorových supresorů a onkogenů (Tabulka 1). Po amplifikaci jsou cílové geny sekvenovány za použití špičkové technologie NGS s minimálním chybovostí.
ONCOTARGET zajišťuje velmi citlivou detekci mutací, což umožňuje sledování pacientů s rakovinou v průběhu léčby nebo detekci relapsu ve velmi raném stádiu. Základní technologie je droplet Digitální PCR, která je podstatně citlivější a robustnější ve srovnání s real-time PCR.
Digitální PCR bylo poprvé vynalezeno Sykes a kol., a to rozdělováním PCR reakce do malých „komůrek“ (kapek) tak, aby každá komůrka obsahovala pouze jeden ´1´ nebo žádný '0' templát, což umožnilo digitální čtení. Po závěrečné amplifikaci se každá komůrka analyzuje na přítomnost cílových fragmentů.
V současné době nabízí GATC testy pro pět běžných nádorových mutací (Tabulka 2). Zde je znázorněn výkon s nejvyšší citlivostí a perfektní korelací v ředících experimentech (Obrázek 8). Další testy pro detekci hotspot mutací v relevantních nádorových genech jako NRAS, PDGFRA, TP53, GNAS, AKT1 a HER2 atd., jsou v současné době ve vývoji.
GATCLIQUID služby - ONCOEXOME,ONCOPANEL a ONCOTARGET - umožňují nový molekulární pohled na biologii nádorů. Tekutá biopsie neumožňuje včasné odhalení nádorů ve fázích, kdy nádorové buňky se ještě nerozšířily, ale testy mohou být použity pro podrobnou molekulární charakterizaci nádoru u pacienta. I když proveditelnost tekuté biopsie závisí na stádiu nádoru, dostupnosti cév a typu nádoru, testy zůstávají slibným nástrojem pro neinvazivní analýzu většiny solidních nádorů (16). Nepochybně, GATCLIQUID vám usnadní molekulární charakterizaci pacientů s nádorovým onemocněním, což je jeden z kroků směrem k personalizované medicíně.