GATCLIQUID: Detekce cirkulující nádorové DNA pomocí tekuté biopsie

Neinvazivní analýzy cirkulující nádorové DNA (ctDNA) a cirkulujících nádorových buněk (CTC) z krevních vzorků, tzv. tekutá biopsie, v poslední době získávají značnou pozornost v klinické oblasti. Popis cirkulující bezbuněčné DNA není zcela nový a první zmínky lze objevit již v roce 1948, kdy Mandel a Métais popsali extracelulární nukleové kyseliny v krevním oběhu. Avšak až v roce 1970 se vědci začali zajímat o cirkulující bezbuněčnou DNA v souvislosti s nádory a bylo popsáno zvýšené množství DNA v séru pacientů s rakovinou. Přesto, buněčný původ této ctDNA byl nejasný.

V roce 1994 dvě pracovní skupiny nezávisle na sobě publikovaly výsledky týkající se detekce mutací asociovaných s nádorem v DNA z plazmy od pacientů s nádorovým onemocněním, a tak prokázaly, že nádorové buňky mohou uvolňovat DNA do oběhu. Od té doby zájem o detekci a analýzu ctDNA prudce vzrostl a to nejen za účelem detekce nádorů, ale také pro sledování účinnosti terapie a pro včasné zachycení rezistence na léky.

Výzkum ctDNA se dotkl mnoha oblastí klinického výzkumu, včetně:

transplantačního výzkumu
detekce virové DNA
neinvazivního prenatálního testování na chromozomální aberace

Avšak sledování ctDNA skýtá i určitá úskalí jako:

nízké hladiny cirkulující DNA ve většině případů
obtížná diskriminace mezi DNA ze zdravých a nádorových buněk
přesná kvantifikace mutovaných fragmentů přítomných na vysokém pozadí fragmentů divokého typu

Optimalizace metod pro komplexní analýzu ctDNA

Právě firma GATC Biotech se v posledních letech intenzivně věnovala optimalizaci metod pro komplexní analýzu ctDNA. V roce 2012, LifeCodexx (sesterská společnost GATC) úspěšně dokončila klinickou studii o neinvazivním prenatálním vyšetření trizomie 21 a byla to první evropská firma, která aplikovala tuto novou testovací metodu.

Kromě toho v rámci veřejně financovaných projektů a s několika klinickými partnery si GATC rozšířila své dovednosti s ctDNA v oblasti onkologie. Díky desítkám tisíc DNA extrakci z plazmy s následným sekvenováním nové generace (NGS), GATC získala velké zkušenosti v analýzách ctDNA. Získané zkušenosti firma zúročila při vytvoření služby GATCLIQUID produktové řady, která zahrnuje:

ONCOEXOME

ONCOPANEL

ONCOTARGET

Pouhé 4 ml plazmy a používání validovaných pracovních postupů (Obrázek 1) při analýze ctDNA může poskytnout odpovědi na obtížné vědecké otázky.

Vynikající citlivost a specifita umožňují GATCLIQUID detekovat nádorovou DNA přítomnou ve velmi nízkých množstvích. Ve srovnání s konvenční tkáňovou biopsií, tekutá biopsie poskytuje minimální klinická rizika a zatížení pacientů s nádorem. Analýza ctDNA řeší problémy týkající se dostupnosti a heterogenity nádorů, které často vedou k neúčinné tkáňové biopsii. Jelikož ctDNA často pochází z rezidentních umírajících nádorových buněk, je možné detekovat nádorovou zátěž ještě předtím, než metastatické nádorové buňky vstoupí do krevního řečiště. Níže je uveden podrobný popis GATCLIQUID metody, včetně pracovních postupů a výhod příslušných analýz.

Obrázek 1: Přehled analýzy ctDNA – znázorněn je postup pro GATCLIQUID ONCOEXOME.

Charakteristika a izolace cirkulující bezbuněčné DNA

Vlastnosti bezbuněčné DNA jsou zcela odlišné ve srovnání s genomovou DNA z tkání a při její extrakci je třeba dodržovat speciální protokoly. Bezbuněčná DNA je přítomna pouze ve velmi nízkých množstvích, je fragmentovaná a obsahuje málo nebo žádnou DNA s vysokou molekulovou hmotností. Buněčná DNA je obalena nukleozómy a není tak přístupná nukleázám, proto je DNA většinou štěpena mezi nukleozómy, což vede ke vzniku charakteristických multimerů o délce ~ 150 bp (Obrázek 2). Tato distribuce velikostí připomíná oligonukleozomální žebříček apoptotických buněk.

Protože je koncentrace bezbuněčné DNA velmi nízká, doporučujeme zpracovávat nejméně 4 ml plazmy (ekvivalent-10 ml krve), která umožní spolehlivé provedení navazujících aplikací.

Plazmu z EDTA zkumavek byste měli připravit rychle do 1 hodiny od odběru krve a okamžitě zmrazit, abyste zabránili zředění bezbuněčné DNA s DNA z lyzovaných krevních buněk (Obrázek 3).

Alternativně specializované sběrné zkumavky pro krev mohou být použity pro stabilizaci bezbuněčné DNA na několik dní. Kromě plazmy, můžete použít pro analýzu bezbuněčné DNA i sérum, ale to je více citlivé na lýzu bílých krvinek, což vede ke zředění bezbuněčné DNA a snížení citlivosti. Z tohoto důvodu, GATC doporučuje používat plazmu oproti séru pro analýzu ctDNA. Pro maximální kvalitu bezbuněčné DNA má GATC optimalizovaný protokol pro přípravu plazmy s přídavným krokem centrifugace pro odstranění všech buněčných stop, což umožnilo úspěšnou přípravu tisíců vzorků. Krátký protokol pro přípravu plazmy je vidět na obrázku 1 dole.

Doporučení pro přípravu plazmy:

Odběr krve do EDTA nebo citrát BCT a příprava plazmy do 1 hodiny.
Alternativně: odběr krve do bezbuněčné DNA BCT(např. Streck) a příprava plazmy v průběhu 48 hodin.
Standardní centrifugace při výkyvu rotoru ven.
Dodatečná centrifugace pro odstranění všech buněčných stop.
Skladování plazmy při -80 °C až do doby extrakce DNA.

Obrázek 2: DNA, její zabalení do nukleozomů a charakteristika distribuce velikostíbezbuněčné DNA. Vlevo: DNA a její zabalení do chromozomů. Vpravo: Typické spektrum bezbuněčné DNA. Většina bezbuněčné DNA odpovídá mono-nukleozomům o velikosti ~ 150 bp a multimerům této velikosti.

ONCOEXOME – Nezkreslený přehled mutací v protein kódujících oblastech

ONCOEXOME je plně automatizovaný vysokokapacitní postup pro obohacení exomu, který umožňuje vědcům objevit somatické nádorové mutace v ctDNA pomocí sekvenování nové generace.

Sekvenování zahrnuje přibližně 120 Mio párových čtení, což vede k pokrytí 120× a více u většiny vzorků. ONCOEXOME dosahuje citlivosti až 5 % a nabízí vysoký výkon v detekci mutací u pacientů s rakovinou (Obrázek 4, 5). Vzhledem k nezkreslené analýze celé kódující oblasti, je možné detekovat nové, stejně jako známé, nádorové mutace (např. mutace anotované v COSMIC databázi) v rámci analyzované ctDNA.

Zatímco tkáňová biopsie často představuje jen malou frakci nádoru, tekutá biopsie na bázi ONCOEXOME může poskytnout ucelený obraz o genetické heterogenitě nádoru. Na obrázku 4 jsme porovnali somatické mutace nalezené v nádorové tkáni pacientů s rakovinou se somatickými mutacemi detekovanými v odpovídající ctDNA ze stejných pacientů.

Vysoký podíl mutací je shodný pro nádorové a ctDNA vzorky (23 až 45 %). Ve dvou případech (rakovina jater a slinivky břišní), ještě více mutací bylo nalezeno v ctDNA než v odpovídající nádorové tkáni pacientů. Jak je znázorněno na obrázku 5, frekvence mutací mezi nádorovou tkání a plazmatickou ctDNA vykazují vysokou korelaci.

Obrázek 3: V průběhu času se koncentrace DNA zvyšuje v důsledku kontaminace DNA z lyzovaných krvinek.

Obrázek 4: Srovnání mutací nalezených ve tkáni nádoru ve srovnání s mutacemi detekovanými v ctDNA. Vennovy diagramy ukazující překryv mezi mutacemi nalezenými v tkáni nádoru a v ctDNA u pacientů s (A) karcinomem jater, (B) dlaždicovým karcinomem hlavy a krku (HNSCC), (C) rakovinou slinivky a (D) ne-malobuněčným karcinomem plic (NSCLC). Pro ujištění, že jsou analyzovány pouze relevantní nádorové mutace, krevní buňky byly analyzovány jako "zdravý referenční materiál" a odpovídající nukleotidová variabilita byla odečtena. Červené kruhy zdůrazňují podíl odhalených mutací, které jsou anotované v COSMIC databázi.

Obrázek 5: Frekvence mutací detekovaných v nádorové tkáni a odpovídající plazmatické ctDNA. Znázorněny jsou frekvence mutací, které byly detekovány v nádoru a v plazmě pacienta s rakovinou jater. Většina z identifikovaných mutací jsou detekovatelné v obou frakcích a vykazují vysokou korelaci.

ONCOPANEL - Screening klíčových nádorových genů

ONCOPANEL je komplexní nádorový panel pro profilování významných nádorových mutací. Pomocí PCR z jedné molekuly, která amplifikuje DNA na miliony kopií, může být ve srovnání s konvenčními PCR přístupy citlivost významně zvýšena. Metoda je optimalizována pro velmi nízké množství DNA a vysoce fragmentovanou DNA, což vede k nezaujatému obohacení široké škály relevantních nádorových cílů a zajištuje účinné zachycení heterogenity nádoru. Panel obsahuje informace o 200 amplikonech v 50 známých genech, které jsou asociovány s nádory, včetně nejdůležitějších nádorových supresorů a onkogenů (Tabulka 1). Po amplifikaci jsou cílové geny sekvenovány za použití špičkové technologie NGS s minimálním chybovostí.

Tabulka 1: Seznam 50 genů zahrnutých v GATCLIQUID ONCOPANEL.

ONCOPANEL dosahuje vynikající pokrytí ve výši až 10 000-krát (Obrázek 6) a pozoruhodnou uniformitu více než 95% při 0,2 x průměrném pokrytí u všech zkoumaných cílů (Obrázek 7).

Obrázek 6: Detekce minoritních alelických frekvencí pomocí GATCLIQUID služeb. GATCLIQUID analýza částí onkogenu KRAS. ONCOEXOME (horní panel) pokrývá všechny kódující oblasti a části 5’-UTR KRAS s pokrytím ~120-krát. Pomocí ONCOPANEL (dolní panel), byly analyzovány vybrané oblasti KRAS s pokrytím až 10 000-krát.

Obrázek 7: Uniformita amplifikovaných cílů při použití GATCLIQUID ONCOPANEL. Na obrázku je znázorněno normalizované pokrytí [log (pokrytí amplikonu/pokrytí panelu)] pro všechny cíle amplifikované tímto nádorovým panelem (n=6).

Ve validačních studiích za použití charakterizované směsi DNA z různých buněčných linií se známými frekvencemi mutací byla provedena kvantifikace minoritních alelických frekvencí (až s 1%) s vynikajícím korelací (R2 = 0,96).

ONCOTARGET - Ultra-citlivé monitorování nádorových mutací

ONCOTARGET zajišťuje velmi citlivou detekci mutací, což umožňuje sledování pacientů s rakovinou v průběhu léčby nebo detekci relapsu ve velmi raném stádiu. Základní technologie je droplet Digitální PCR, která je podstatně citlivější a robustnější ve srovnání s real-time PCR.

Digitální PCR bylo poprvé vynalezeno Sykes a kol., a to rozdělováním PCR reakce do malých „komůrek“ (kapek) tak, aby každá komůrka obsahovala pouze jeden ´1´ nebo žádný '0' templát, což umožnilo digitální čtení. Po závěrečné amplifikaci se každá komůrka analyzuje na přítomnost cílových fragmentů.

V dnešní době, je rozčlenění PCR směsi realizováno pomocí olejové emulze, což má za následek mnohem vyšší počet komůrek. Digitální PCR kvantifikuje absolutní počet templátů a nespoléhá se na standardní křivky. Kromě toho, že je velmi robustní vůči inhibitorům, tak také minimalizuje efekt neoptimální amplifikační účinnosti.

V současné době nabízí GATC testy pro pět běžných nádorových mutací (Tabulka 2). Zde je znázorněn výkon s nejvyšší citlivostí a perfektní korelací v ředících experimentech (Obrázek 8). Další testy pro detekci hotspot mutací v relevantních nádorových genech jako NRAS, PDGFRA, TP53, GNAS, AKT1 a HER2 atd., jsou v současné době ve vývoji.

Tabulka 2: Mutace testované pomocí GATCLIQUID ONCOTARGET.

Obrázek 8: Korelace mezi sledovanými a očekávanými frekvencemi při použití GATCLIQUID ONCOTARGET. Nádorové vzorky s dobře charakterizovanými frekvencemi mutací byly analyzovány. I přes mutační frekvenci 0.1 % bylo dosaženo vynikající korelace mezi sledovanými a očekávanými frekvencemi.

Závěr

GATCLIQUID služby - ONCOEXOME,ONCOPANEL a ONCOTARGET - umožňují nový molekulární pohled na biologii nádorů. Tekutá biopsie neumožňuje včasné odhalení nádorů ve fázích, kdy nádorové buňky se ještě nerozšířily, ale testy mohou být použity pro podrobnou molekulární charakterizaci nádoru u pacienta. I když proveditelnost tekuté biopsie závisí na stádiu nádoru, dostupnosti cév a typu nádoru, testy zůstávají slibným nástrojem pro neinvazivní analýzu většiny solidních nádorů (16). Nepochybně, GATCLIQUID vám usnadní molekulární charakterizaci pacientů s nádorovým onemocněním, což je jeden z kroků směrem k personalizované medicíně.

Reference

Mandel, P. & Metais, P., 1948, Les acides nucleiques du plasma sanguin chez l’homme. C. R. Seances Soc. Biol. Fil. 142: 241-243.
Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff D. M. and Yaros, M. J,. 1977, Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37: 646-650.
Sorenson, G. D., Pribish D. M., Valone F. H., Memoli V. A., Bzik D. J. and Yao S. L., 1994, Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 3: 67-71.
Vasioukhin V., Anker P., Maurice P., Lyautey J., Lederrey C. and Stroun M., 1994, Point mutations of the N-ras gene in the blood plasma DNA of patients with myelodysplastic syndrome or acute myelogenous leukaemia. Br. J. Haematol. 86: 774-779.
Lo Y. M., Tein M. S., Pang C. C., Yeung C. K., Tong K. L. and Hjelm N.M., 1998, Presence of donor-specific DNA in plasma of kidney and liver-transplant recipients. Lancet (London, England) 351: 1329-1330.
Gan, Y. J., Sullivan, J. L. and Sixbey, J. W., 1994, Detection of cell free Epstein-Barr virus DNA in serum during acute infectious mononucleosis. J. Infect. Dis. 170: 436-439.
Lo Y. M., Patel P., Wainscoat J. S., Sampietro M., Gillmer M. D. and Fleming K. A., 1989, Prenatal sex determination by DNA amplification from maternal peripheral blood. Lancet (London, England) 2: 1363-1365.
Lo Y. M., Lo E. S., Watson N., Noakes L., Sargent I. L. ,Thilaganathan B. and Wainscoat J. S., 1996, Two-way cell traffic between mother and fetus: biologic and clinical implications. Blood 4390-4395.
Stumm M., Entezami M., Haug K., Blank C., Wüstemann M., Schulze B., Raabe-Meyer G., Hempel M., Schelling M., Ostermayer E., Langer-Freitag S., Burkhardt T., Zimmermann R., Schleicher T., Weil B., Schöck U., Smerdka P., Grömminger S., Kumar Y. and Hofmann W., 2014, Diagnostic accuracy of random massively parallel sequencing for non-invasive prenatal detection of common autosomal aneuploidies: a collaborative study in Europe. Prenat. Diagn. 34: 185-191.
Jahr S., Hentze H., Englisch S., Hardt D., Fackelmayer F. O., Hesch R. D. and Knippers R., 2001, DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: Quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells. Cancer Res. 61: 1659-1665.
Norton S. E., Luna K. K., Lechner J. M., Qin J. and Fernando M. R., 2013, A new blood collection device minimizes cellular DNA release during sample storage and shipping when compared to a standard device. J. Clin. Lab. Anal. 27: 305-311.
Hindson C. M., Chevillet J. R., Briggs H.A., Gallichotte E. N., Ruf I. K., Hindson B. J., Vessella R. L. and Tewari M., 2013, Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat. Methods 10: 1003-1005.
Sykes P. J., Neoh S. H., Brisco M. J., Hughes E., Condon J. and Morley A. A., 1992, Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques 13: 444-449.
Wittenberger T., Sleigh S., Reisel D., Zikan M., Wahl B., Alunni-Fabbroni M., Jones A., Evans I., Koch J., Paprotka T., Lempiäinen H., Rujan T., Rack B., Cibula D. and Widschwendter M., 2014, DNA methylation markers for early detection of women’s cancer: promise and challenges. Epigenomics 6: 311-327.
Yang R., Paparini A., Monis P. and Ryan U., 2014, Comparison of next-generation droplet digital PCR (ddPCR) with quantitative PCR (qPCR) for enumeration of Cryptosporidium oocysts in faecal samples. Int. J. Parasitol. 44:, 1105-1113.
Bettegowda, C. et al., 2014, Detection of circulating tumor DNA in early- and late-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6:224ra24.

Tisknout

nahoru

GATCLIQUID: Detekce cirkulující nádorové DNA pomocí tekuté biopsie