Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kit je určen pro rychlou a účinnou izolaci vysoce kvalitní genomové DNA z různých savčích buněčných kultur a tkání, vzorků plné krve, bakterií a kvasinek. Kit využívá technologii silikagelových membrán v podobě pohodlných kolonek, což eliminuje potřebu drahých pryskyřic, extrakci toxickým fenol-chloroformem nebo časově náročné srážení alkoholem. Standardní postup trvá méně než 20 minut po lýze buněk a poskytuje čistou DNA větší než 30kb. Izolovaná DNA může být použita přímo v PCR, Southern blotech a enzymatických reakcí.
|
Zdroj |
Množství | Výtěžek (μg) |
| Savčí krev | 200 μl | 4-6 |
| Myší srdce | 10 mg | 10-15 |
| Myší ocas | 0,5 cm | 8-10 |
| Krysí játra | 10 mg | 10-20 |
| Krysí slezina | 5 mg | 20-30 |
| Krysí ledvina | 10 mg | 25-30 |
| Králičí ucho | 20 mg | 5-10 |
| Bacillus pumilis buňky | 2x109 buněk | 10-15 |
| Escherichia coli buňky | 2x109 buněk | 10-15 |
| HeLa buňky | 2x106 buněk | 15-20 |
| Jurkat buňky | 5x106 buněk | 25-30 |
| Saccharomyces cerevisiae buňky | 1x108 buněk | 3-5 |
1. Rozbijte/rozetřete až 20 mg savčí tkáně (použijte až 10 mg tkáně sleziny), 0,6 cm (krysa) nebo 0,5 cm (myš) ocasu v kapalném dusíku za použití třecí misky a tloučku. Alternativně, nařežte tkáně na malé kousky nebo použijte homogenizátor.
2. Posbírejte materiál do 1,5 ml mikrozkumavky (není součástí kitu) a rozmíchejte v 180 ul Digestion Solution. Přidejte 20 ul roztoku Proteinázy K a promíchejte důkladně protřepáním nebo pipetováním pro získání uniformní suspenze.
3. Inkubujte vzorek při teplotě 56 °C, dokud se tkáň zcela nezlyzuje a nejsou viditelné žádné kousky. Během inkubace občas vortexujte zkumavku nebo použijte třepací vodní lázeň, třepací platformu nebo termomixér.
| Množství | Inkubační doba |
| 5 mg tkáně (kromě sleziny) | 1 hodina |
| 10 mg tkáně (kromě sleziny) | 2 hodiny |
| 20 mg tkáně (kromě sleziny) | 3 hodiny |
| 5 mg sleziny | 2 hodiny |
| 10 mg sleziny | 3 hodiny |
| Myší ocas (0.5 cm), krysí ocas (0.6 cm) | 6 hodin |
4. Přidejte 20 ul roztoku RNázy A, promíchejte vortexováním a pak inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě.
5. Přidejte 200 ul Lysis Solution. Důkladně promíchejte vortexováním po dobu 15 sekund, dokud není směs homogenní.
6. Přidejte 400 ul 50% etanolu a promíchejte pomocí pipety nebo vortexováním.
1. a) Suspenze buněk
Přeneste až 5 × 106 buněk do centrifugační zkumavky. Sedimentujte buňky centrifugací po dobu 5 minut při 250 × g. Odstraňte supernatant. Opláchněte buňky jednou s PBS kvůli odstranění zbytkového média a opakujte krok centrifugace. Odstraňte supernatant.
b) Adherentní buňky
Odstraňte růstové médium z kultivační misky, která obsahuje až 2 × 106 buněk. Opláchněte buňky jednou s PBS, aby se odstranilo zbytkové médium. Odstraňte PBS. Oddělte buňky z kultivační destičky škrabkou ve vhodném objemu PBS nebo trypsinizací. Přeneste buňky do mikrozkumavky a sedimentujte je centrifugací po dobu 5 minut při 250 xg. Odstraňte supernatant.
2. Peletu buněk získanou v kroku 1a nebo 1b rozpusťte ve 200 ul TE pufru nebo PBS. Přidejte 200 ul Lysis Solution a 20 ul roztoku Proteinázy K k buněčné peletě. Směs důkladně promíchejte vortexováním nebo pipetováním pro získání uniformní suspenze.
3. Inkubujte vzorek při teplotě 56 °C. Během inkubace občas vortexujte zkumavku nebo použijte třepací vodní lázeň, třepací platformu nebo termomixér, dokud nejsou buňky zcela lyzovány (10 minut).
4. Přidejte 20 ul roztoku RNázy A, promíchejte vortexováním a pak inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě.
5. Přidejte 400 ul 50% etanolu a promíchejte pomocí pipety nebo vortexováním.
6. Přeneste připravený lyzát na GeneJET kolonku, která je vložená do sběrné zkumavky. Centrifugujte kolonku po dobu 1 minuty při 6000 x g. Vyhoďte sběrnou zkumavku s protečeným roztokem. Umístěte GeneJET kolonku do nové 2 ml sběrné zkumavky (v kitu).
7. Přidejte 500 ul Wash Buffer I (s přidaným etanolem). Centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 x g. Vyhoďte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do sběrné zkumavky.
8. Přidejte 500 ul Wash Buffer II (s přidaným etanolem) na GeneJET kolonku. Centrifugujte 3 minuty při maximální rychlosti (≥ 12000 × g). Volitelné. Pokud je na kolonce vidět zbytkový roztok, vylijte zkumavku a znovu centrifugujte po dobu 1 minuty při maximální rychlosti. Vyhoďte zkumavku s protečeným roztokem a přeneste kolonku do sterilní 1,5 ml mikrozkumavky (není součástí kitu).
9. Přidejte 200 ul elučního pufru do středu GeneJET kolonky a eluujte genomovou DNA. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 × g.
Poznámka:
- Pro maximální výnos DNA, opakujte eluční krok s dalšími 200 ul elučního pufru.
- Pokud je požadována více koncentrovaná DNA nebo DNA se izoluje z malého množství výchozího materiálu (např. ≤1×106 savčích buněk) objem elučního pufru přidaného do kolonky může být snížen až na 50-100 ul. Mějte prosím na paměti, že menší objem elučního pufru bude mít za následek menší množství eluované DNA.
10. Vyhoďte kolonku. Okamžitě použijte purifikovanou DNA v dalších aplikacích nebo skladujte DNA při -20 °C.
1. Přidejte 400 ul Lysis Solution a 20 ul roztoku Proteinázy K k 200 μl plné krve. Směs důkladně promíchejte vortexováním nebo pipetováním pro získání uniformní suspenze.
2. Inkubujte vzorek při teplotě 56 °C. Během inkubace občas vortexujte zkumavku nebo použijte třepací vodní lázeň, třepací platformu nebo termomixér, dokud nejsou buňky zcela lyzovány (10 minut).
3. Přidejte 200 ul etanolu (96-100%) a promíchejte pomocí pipety nebo vortexováním.
5. Přidejte 500 ul Wash Buffer I (s přidaným etanolem). Centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 x g. Vyhoďte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do sběrné zkumavky.
6. Přidejte 500 ul Wash Buffer II (s přidaným etanolem) na GeneJET kolonku. Centrifugujte 3 minuty při maximální rychlosti (≥ 12000 × g). Volitelné. Pokud je na kolonce vidět zbytkový roztok, vylijte zkumavku a znovu centrifugujte po dobu 1 minuty při maximální rychlosti. Vyhoďte zkumavku s protečeným roztokem a přeneste kolonku do sterilní 1,5 ml mikrozkumavky (není součástí kitu).
7. Přidejte 200 ul elučního pufru do středu GeneJET kolonky a eluujte genomovou DNA. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 × g.
Poznámka:
- Pro maximální výnos DNA, opakujte eluční krok s dalšími 200 ul elučního pufru.
- Pokud je požadována více koncentrovaná DNA nebo DNA se izoluje z malého množství výchozího materiálu (např. 50 ul) objem elučního pufru přidaného do kolonky může být snížen až na 50-100 ul. Mějte prosím na paměti, že menší objem elučního pufru bude mít za následek menší množství eluované DNA.
8. Vyhoďte kolonku. Okamžitě použijte purifikovanou DNA v dalších aplikacích nebo skladujte DNA při -20 °C.
1. Přeneste až 2 × 109 bakteriálních buněk do 1,5 nebo 2 ml mikrozkumavky a centrifugujte po dobu 10 minut při 5000 x g. Odstraňte supernatant.
2. Rozpusťte peletu buněk v 180 ul Digestion Solution. Přidejte 20 ul Proteinázy K a důkladně promíchejte vortexováním nebo pipetováním pro získání uniformní suspenze.
3. Inkubujte vzorek při teplotě 56 °C. Během inkubace občas vortexujte zkumavku nebo použijte třepací vodní lázeň, třepací platformu nebo termomixér, dokud nejsou buňky zcela lyzovány (∼30 minut).
4. Přidejte 20 ul roztoku RNázy A, promíchejte vortexováním a pak inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě.
5. Přidejte 200 ul Lysis Solution. Důkladně promíchejte vortexováním po dobu 15 sekund, dokud není směs homogenní.
6. Přidejte 400 ul 50% etanolu a promíchejte pomocí pipety nebo vortexováním.
7. Přeneste připravený lyzát na GeneJET kolonku, která je vložená do sběrné zkumavky. Centrifugujte kolonku po dobu 1 minuty při 6000 x g. Vyhoďte sběrnou zkumavku s protečeným roztokem. Umístěte GeneJET kolonku do nové 2 ml sběrné zkumavky (v kitu).
8. Přidejte 500 ul Wash Buffer I (s přidaným etanolem). Centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 x g. Vyhoďte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do sběrné zkumavky.
9. Přidejte 500 ul Wash Buffer II (s přidaným etanolem) na GeneJET kolonku. Centrifugujte 3 minuty při maximální rychlosti (≥ 12000 × g). Volitelné. Pokud je na kolonce vidět zbytkový roztok, vylijte zkumavku a znovu centrifugujte po dobu 1 minuty při maximální rychlosti.
Vyhoďte zkumavku s protečeným roztokem a přeneste kolonku do sterilní 1,5 ml mikrozkumavky (není součástí kitu).
10. Přidejte 200 ul elučního pufru do středu GeneJET kolonky a eluujte genomovou DNA. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 × g.
Poznámka:
• Pro maximální výnos DNA, opakujte eluční krok s dalšími 200 ul elučního pufru.
• Pokud je požadována více koncentrovaná DNA nebo DNA se izoluje z malého množství výchozího materiálu, tak objem elučního pufru přidaného do kolonky může být snížen až na 50-100 ul. Mějte prosím na paměti, že menší objem elučního pufru bude mít za následek menší množství eluované DNA.
11. Vyhoďte kolonku. Okamžitě použijte purifikovanou DNA v dalších aplikacích nebo skladujte DNA při -20 °C.
1. Přeneste až 2 × 109 bakteriálních buněk do 1,5 nebo 2 ml mikrozkumavky a centrifugujte po dobu 10 minut při 5000 x g. Odstraňte supernatant.
2. Rozpusťte peletu buněk v 180 ul Gram-positive bacteria lysis buffer. Inkubujte 30 minut při teplotě 37°C.
3. Přidejte 200 ul Lysis Solution a 20 μl Proteinázy K. Důkladně promíchejte vortexováním nebo pipetováním, dokud není směs homogenní.
4. Inkubujte vzorek při teplotě 56 °C. Během inkubace občas vortexujte zkumavku nebo použijte třepací vodní lázeň, třepací platformu nebo termomixér, dokud nejsou buňky zcela lyzovány (∼30 minut).
5. Přidejte 20 ul roztoku RNázy A, promíchejte vortexováním a pak inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě.
6. Přidejte 400 ul 50% etanolu a promíchejte pomocí pipety nebo vortexováním.
7. Přeneste připravený lyzát na GeneJET kolonku, která je vložená do sběrné zkumavky. Centrifugujte kolonku po dobu 1 minuty při 6000 x g. Vyhoďte sběrnou zkumavku s protečeným roztokem. Umístěte GeneJET kolonku do nové 2 ml sběrné zkumavky (v kitu).
8. Přidejte 500 ul Wash Buffer I (s přidaným etanolem). Centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 x g. Vyhoďte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do sběrné zkumavky.
9. Přidejte 500 ul Wash Buffer II (s přidaným etanolem) na GeneJET kolonku. Centrifugujte 3 minuty při maximální rychlosti (≥ 12000 × g). Volitelné. Pokud je na kolonce vidět zbytkový roztok, vylijte zkumavku a znovu centrifugujte po dobu 1 minuty při maximální rychlosti.
Vyhoďte zkumavku s protečeným roztokem a přeneste kolonku do sterilní 1,5 ml mikrozkumavky (není součástí kitu).
10. Přidejte 200 ul elučního pufru do středu GeneJET kolonky a eluujte genomovou DNA. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 × g.
Poznámka:
• Pro maximální výnos DNA, opakujte eluční krok s dalšími 200 ul elučního pufru.
• Pokud je požadována více koncentrovaná DNA nebo DNA se izoluje z malého množství výchozího materiálu, tak objem elučního pufru přidaného do kolonky může být snížen až na 50-100 ul. Mějte prosím na paměti, že menší objem elučního pufru bude mít za následek menší množství eluované DNA.
11. Vyhoďte kolonku. Okamžitě použijte purifikovanou DNA v dalších aplikacích nebo skladujte DNA při -20 °C.
1. Přeneste až 2 × 108 kvasinkových buněk do 1,5 nebo 2 ml mikrozkumavky a centrifugujte po dobu 5-10 sekund při maximální rychlosti ≥12000 × g. Odstraňte supernatant.
2. Rozpusťte peletu buněk v 500 ul Yeast lysis buffer. Inkubujte 1 hodinu při teplotě 37°C.
3. Centrifugujte buňky po dobu 10 minut při 3000 × g. Odstraňte supernatant.
4. Rozpusťte peletu buněk v 180 ul Digestion Solution. Přidejte 20 ul Proteinázy K a důkladně promíchejte vortexováním nebo pipetováním pro získání uniformní suspenze.
5. Inkubujte vzorek při teplotě 56 °C. Během inkubace občas vortexujte zkumavku nebo použijte třepací vodní lázeň, třepací platformu nebo termomixér, dokud nejsou buňky zcela lyzovány (∼ 45 minut).
6. Přidejte 20 ul roztoku RNázy A, promíchejte vortexováním a pak inkubuje po dobu 10 minut při pokojové teplotě.
7. Přidejte 200 ul Lysis Solution. Důkladně promíchejte vortexováním po dobu 15 sekund, dokud není směs homogenní.
8. Přidejte 400 ul 50% etanolu a promíchejte pomocí pipety nebo vortexováním.
9. Přeneste připravený lyzát na GeneJET kolonku, která je vložená do sběrné zkumavky. Centrifugujte kolonku po dobu 1 minuty při 6000 x g. Vyhoďte sběrnou zkumavku s protečeným roztokem. Umístěte GeneJET kolonku do nové 2 ml sběrné zkumavky (v kitu).
10. Přidejte 500 ul Wash Buffer I (s přidaným etanolem). Centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 x g. Vyhoďte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do sběrné zkumavky.
11. Přidejte 500 ul Wash Buffer II (s přidaným etanolem) na GeneJET kolonku. Centrifugujte 3 minuty při maximální rychlosti (≥ 12000 × g). Volitelné. Pokud je na kolonce vidět zbytkový roztok, vylijte zkumavku a znovu centrifugujte po dobu 1 minuty při maximální rychlosti.
Vyhoďte zkumavku s protečeným roztokem a přeneste kolonku do sterilní 1,5 ml mikrozkumavky (není součástí kitu).
12. Přidejte 200 ul elučního pufru do středu GeneJET kolonky a eluujte genomovou DNA. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 1 minuty při 8000 × g.
Poznámka:
- Pro maximální výnos DNA, opakujte eluční krok s dalšími 200 ul elučního pufru.
- Pokud je požadována více koncentrovaná DNA nebo DNA se izoluje z malého množství výchozího materiálu, tak objem elučního pufru přidaného do kolonky může být snížen až na 50-100 ul. Mějte prosím na paměti, že menší objem elučního pufru bude mít za následek menší množství eluované DNA.
13. Vyhoďte kolonku. Okamžitě použijte purifikovanou DNA v dalších aplikacích nebo skladujte DNA při -20 °C.
