Upravit stránku

GeneJET Plasmid DNA Purification Kity

Tento typ kitů slouží k rychlé izolaci vysoce kvalitní plasmidové DNA v množství mikrogramů až miligramů. Mezi základní parametry a hlavní výhody GeneJET Plasmid DNA purifikačních kitů patří především:

  • vysoce kvalitní plasmidová DNA
  • vysoké výnosy a koncentrace purifikované DNA
  • různé množstevní formáty: mini, midi a maxi
  • protokoly pro centrifugy a vakuové systémy

Přehled podtémat a protokolů pro rychlejší orientaci:


1) GeneJET Plasmid Miniprep Kit

GeneJET Plasmid Miniprep Kit využívá exkluzivní technologii založenou na silikagelových membránách ve formě pohodlných kolenek. Kit vám tak poskytne až 20 ug vysoce kopiové plasmidové DNA z jedné izolace.

Výhody Miniprep kitu:

  • velmi efekitvní - vysoké výnosy, až 20 ug kvalitní plasmidové DNA
  • rychlý - postup zabere méně než 14 minut
  • pohodlný - žádná fenol/chloroformová extrakce nebo srážení alkoholem
  • vysoká čistota - čistá DNA je okamžitě připravena pro další aplikace

Možnosti využití kitu:

GeneJET Plasmid Miniprep Kit je možné použít k rychlé izolaci vysoce čisté plasmidové DNA, která je vhodná pro všechny běžné aplikace molekulární biologie, především pak: FastDigest nebo konvenční restrikční štěpení, automatizované fluorescenční nebo radioaktivní sekvenování, PCR, in vitro transkripce, transformace.

Princip izolace plasmidové DNA:

Bakteriální kultura se nejprve sklidí a lyzuje. Vytvořený lyzát je následně přečištěn centrifugací a aplikuje se na silikagelovou kolonku, na kterou se při vysoké koncentraci solí selektivně navážou molekuly DNA. Absorbovaná DNA se promyje, aby se odstranily kontaminující látky, a čistá plasmidová DNA se eluuje v malém objemu elučního pufru nebo vody. Čistá DNA je připravena k okamžitému použití pro všechny aplikace molekulární biologie, například pro rychlé a konvenční štěpení restrikčními enzymy, PCR, in vitro transkripci, transformaci a automatizované sekvenování.

Protokol k GeneJET Plasmid Miniprep kitu

Před uvedením samotného protokolu je třeba zmínit, že všechny kroky byly prováděny při pokojové teplotě. Všechna odstředění provádějte nejlépe v mikrocentrifuzep při ≥ 12 000 x g (10 000 až 14 000 rpm, v závislosti na typu rotoru). Bakteriální kulturu sklízejte centrifugací při 8 000 rpm (6 800 x g) v mikrocentrifuze po dobu 2 minut při pokojové teplotě. Odstraňte supernatant a také veškeré zbývající médium.

1. Rozpuštění, lýze a neutralizace buněkK peletě buněk přidejte: 250 μL Resuspension Solution a vortexujte, 250 μL Lysis Solution a převraťte zkumavku 4 - 6krát, 350 μL Neutralization Solution převraťte zkumavku 4 - 6krát, centrifugujte 5 minut.
2. Navázání DNAPřeneste supernatant do GenetJET Spin Column (kolonka) a následně centrifugujte 1 minutu.
3. Promytí kolonkyPřidejte 500 μL Wash Solution a centrifugujte 30 - 60 sekund. Odstraňte protečený roztok a promytí opakujte dvakrát. Prázdnou kolonku centrifugujte 1 minutu.
4. Eluce purifikované DNAPřeneste kolonku do nové zkumavky a přidejte na ni 50 μL Elution Buffer. Inkubujte 2 minuty. Poté centrifugujte 2 minuty a protečený roztok uschovejte, neboť obsahuje získanou DNA.

2) GeneJET Plasmid Midiprep Kit

GeneJET Plasmid Midiprep Kit je určen k izolaci vysoce kvalitní plasmidové DNA ve velkém měřítku z rekombinantní kultury E. coli. Kit využívá technologii založenou na silikagelových membránách ve formě pohodlných kolonek. Každá purifikace poskytuje až 200 ug vysoce kopiové plasmidové DNA. Čistá plasmidovou DNA můžete použít v nejrůznějších aplikacích molekulární biologie, například při štěpení restrikční endonukleázy, PCR, klonování, transformaci, automatizovaném sekvenování, in vitro transkripci a transfekci robustních buněčných linií.

Výhody Midiprep kitu:

  • efektivita - výtěžky až 200 ug vysoce kvalitní plasmidové DNA z 50 ml bakteriální kultury
  • vysoká koncentrace čisté DNA - > 400 ng / ul
  • pohodlí - formát kolonek, protokoly pro centrifugy nebo vakuové systémy
  • rychlost - celý postup trvá 60 minut, je podstatně rychlejší než při použití kolonek s gravitačním průtokem

Možnosti využití kitu:

Samotnou plasmidovou DNA opět využijete pro všechny běžné aplikace molekulární biologie, především pak při štěpení restrikčním enzymem FastDigest, automatizovaném fluorescenčním sekvenování, PCR, klonování, transformaci, in vitro transkripci a transfekci robustních buněčných liní.

Protokoly k GeneJET Plasmid Midiprep kitu

GeneJET Plasmid Midi Prep Kit poskytuje optimalizované protokoly pro purifikaci plasmidové DNA s použitím nízkorychlostní (až 5 000 × g) a vysokorychlostní (až 48 000 × g) centrifugy, a také s použitím vakuového kolektoru.

A) Purifikace plasmidové DNA s použitím NÍZKORYCHLOSTNÍ CENTRIFUGY

1. Vypěstujte až 50 ml bakteriální kultury s OD600 = 2 - 3. Pro dosažení nejlepších výsledků vypočtěte maximální možný objem buněčné kultury.

Maximální objem kultury (ml) = 150/OD600. Sklizeň buněk proveďte centrifugací po dobu 10 minut při 5 000 x g. Odstraňte supernatant.
2. Rozpusťte peletu buněk ve 2 ml Resuspension Solution. Bakteriální pelety by měly být resuspendovány votexováním nebo pipetováním nahoru a dolů, dokud nejsou viditelné žádné buněčné shluky.Nevortexujte, abyste zabránili lámání chromozomální DNA. Neinkubujte déle než 3 min, abyste zabránili denaturaci nadšroubovicové plasmidové DNA.
3. Přidejte 2 ml Lysis Solution a jemně promíchejte převracením zkumavky 4 - 6krát, dokud se roztok nestane viskózní a lehce průhledný. Inkubujte po dobu 3 minut při pokojové teplotě.Nevortexujte, abyste zabránili lámání chromozomální DNA. Neinkubujte déle než 3 min, abyste zabránili denaturaci nadšroubovicové plasmidové DNA.

4. Přidejte 2 ml Neutralization Solution a okamžitě promíchejte převracením zkumavky 5 - 8krát.

X
5. Přidejte 0,5 ml Endotoxin Binding Reagent. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5 - 8 krát. Inkubujte po dobu 5 minut při pokojové teplotě.Po přidání neutralizačního roztoku a Endotoxin Binding Reagent míchejte jemně, ale důkladně, abyste zabránili lokálnímu vysrážení bakteriálního buněčného odpadu. Neutralizovaný bakteriální lyzát by měl být zakalený (s obsahem bílé sraženiny).
6. Přidejte 3 ml 96% ethanolu. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5 - 6 krát.X
7. Centrifugujte 40 minut při 4,000 - 5,000 × g. Takto shromáždíte buněčný debris a chromozomální DNA.Pokud upřednostňujete vakuový systém, pokračujte v protokolu určeném pro tento typ purifikace.
8. Přeneste supernatant do 15ml zkumavky (není součástí kitu) dekantací, nebo pipetováním. Pozor na porušení nebo přenos bílé sraženiny. Přidejte 3 ml 96% ethanolu. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5 - 6 krát.X
9. Přeneste část vzorku (~ 5,5 ml) na kolonku umístěnou ve sběrné zkumavce (15 ml). Dávejte pozor, abyste kolonku nepřeplnili. Centrifugujte 3 min při 2 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.Po použití pečlivě (těsně) uzavřete sáček s kolonkami!

10. Opakujte krok 9 a zpracujte veškerý zbývající lyzát.

X
11. Přidejte 4 ml Wash Solution I (zředěný s isopropanolem, jak je popsáno v manuálu). Centrifugujte po dobu 2 min. při 3 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.X
12. Přidejte 4 ml Wash Solution II (zředěný s ethanolem, jak je popsáno v manuálu) Centrifugujte po dobu 2 min. při 3 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.X

13. Opakujte promytí kolonky Wash Solution II (krok 12).

X

14. Centrifugujte po dobu 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru pro odstranění zbytků promývacího roztoku. Odstraňte sběrnou zkumavku s protečeným roztokem.

X
15. Přeneste kolonku do nové 15 ml zkumavky (v kitu). Přidejte 0,35 ml Elution Buffer do středu kolonky. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 5 minut při 3000 × g v kyvetovém rotoru pro eluci plasmidové DNA.

Pro zvýšení koncentrace eluované DNA může být objem elučního pufru snížen na 0,25 ml. Mějte ale na paměti, že nižší objem elučního pufru sníží celkový výnos DNA. Chcete-li zvýšit celkový výtěžek DNA o 20 - 30%, proveďte další eluci pomocí pufru (0,15 ml).

16. Vyhoďte purifikační kolonku. Purifikovanou plasmidovou DNA použijte v následujících aplikacích nebo ji uskladněte při teplotě - 20 °C.

X
B) Purifikace plasmidové DNA s použitím VYSOKORYCHLOSTNÍ CENTRIFUGY

1. Vypěstujte až 50 ml bakteriální kultury s OD600 = 2-3. Pro dosažení nejlepších výsledků vypočtěte maximální možný objem buněčné kultury.

Maximální objem kultury (ml) = 150/OD600. Sklizeň buněk proveďte centrifugací po dobu 10 minut při 5 000 x g. Odstraňte supernatant.
2. Rozpusťte peletu buněk ve 2 ml Resuspension Solution. Bakteriální pelety by měly být resuspendovány votexováním nebo pipetováním nahoru a dolů, dokud nejsou viditelné žádné buněčné shluky.Ujistěte se, že RNase A Solution byl přidán do roztoku, jak je popsáno v manuálu.
3. Přidejte 2 ml Lysis Solution a jemně promíchejte převracením zkumavky 4 - 6krát, dokud roztok nebude viskózní a lehce průhledný. Inkubujte po dobu 3 minut při pokojové teplotě.Nevortexujte, abyste zabránili lámání chromozomální DNA. Neinkubujte déle než 3 min, abyste zabránili denaturaci nadšroubovicové plasmidové DNA.

4. Přidejte 2 ml Neutralization Solution a okamžitě promíchejte převracením zkumavky 5 - 8krát.

X
5. Přidejte 0,5 ml Endotoxin Binding Reagent. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5 - 8 krát. Inkubujte po dobu 5 minut při pokojové teplotě.Po přidání neutralizačního roztoku a Endotoxin Binding Reagent je důležité, aby míchání bylo jemné, ale důkladné, aby se zabránilo lokálnímu vysrážení bakteriálního buněčného odpadu. Neutralizovaný bakteriální lyzát by měl být zakalený a obsahovat bílou sraženinu.
6. Centrifugujte 20 minut při 20 000 rpm (48 000 × g). Takto shromáždíte buněčný debris a chromozomální DNA.Pokud upřednostňujete vakuový systém, pokračujte v protokolu určeném pro tento typ purifikace. Používejte pouze doporučenou rychlost centrifugace.
7. Přeneste supernatant do 15ml zkumavky (není součástí kitu) dekantací, nebo pipetováním. Vyhněte porušení nebo přenosu bílé sraženiny. Přidejte 1 objem ethanolu. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5-6 krát.X
8. Přeneste část vzorku (~ 5,5 ml) na kolonku umístěnou ve sběrné zkumavce (15 ml). Dávejte pozor, abyste kolonku nepřeplnili. Centrifugujte 3 min při 2 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.Po použití pečlivě (těsně) uzavřete sáček s kolonkami!

9. Opakujte krok 8 a zpracujte veškerý zbývající lyzát.

X

10. Přidejte 4 ml Wash Solution I (zředěný s isopropanolem, jak je popsáno v manuálu). Centrifugujte po dobu 2 min. při 3 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.

X
11. Přidejte 4 ml Wash Solution II (zředěný s ethanolem, jak je popsáno v manuálu) Centrifugujte po dobu 2 min. při 3 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.X
12. Opakujte promytí kolonky Wash Solution II (krok 11).X

13. Centrifugujte po dobu 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru, abyste odstranili zbytky promývacího roztoku. Odstraňte sběrnou zkumavku s protečeným roztokem.

X

14. Přeneste kolonku do nové 15ml zkumavky (v kitu). Přidejte 0,35 ml Elution Buffer do středu kolonky. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru pro eluci plasmidové DNA.

Pro zvýšení koncentrace eluované DNA může být objem elučního pufru snížen na 0,25 ml. Mějte ale na paměti, že nižší objem elučního pufru sníží celkový výnos DNA. Chcete-li zvýšit celkový výtěžek DNA o 20 - 30%, proveďte další eluci pomocí pufru (0,15 ml).
15. Vyhoďte purifikační kolonku. Použijte purifikovanou plasmidovou DNA v následných aplikacích nebo uskladněte DNA při teplotě -20 °C.

X

C) Purifikace plasmidové DNA s použitím VAKUOVÉHO SYSTÉMU

1. Proveďte sběr buněk, lýzu a zpracování lyzátu podle kroků 1-8 v protokolu A nebo kroků 1-7 v protokolu B.

X

2. Připravte si vakuový systém podle pokynů dodavatele. Umístěte GeneJET Midi
purifikační kolonku do systému.

X
3. Přeneste část vzorku (~ 5,5 ml) na kolonku. Dávejte pozor, abyste kolonku nepřeplnili. Aplikujte vakuum, aby roztok protekl skrz kolonku. Jakmile projde veškerý roztok, vypněte vakuum.Po použití pečlivě (těsně) uzavřete sáček s kolonkami!

4. Opakujte krok 3 a zpracujte veškerý zbývající lyzát.

X
5. Přidejte 4 ml Wash Solution I (zředěný s isopropanolem, jak je popsáno v manuálu). Aplikujte vakuum, aby roztok protekl skrz kolonku. Vypněte vakuum, jakmile projde veškerý roztok.X
6. Přidejte 4 ml Wash Solution II (zředěný s ethanolem, jak je popsáno v manuálu) Aplikujte vakuum, aby roztok protekl skrz kolonku. Vypněte vakuum, jakmile projde veškerý roztok.X

7. Opakujte promytí kolonky Wash Solution II (krok 6).

X
8. Pro vysušení kolonky aplikujte vakuum po dobu 10 minut, nebo přeneste kolonku do nové 15ml sběrné zkumavky a centrifugujte 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru.X

9. Přeneste kolonku do nové 15 ml zkumavky (v kitu). Přidejte 0,35 ml Elution Buffer do středu kolonky. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru pro eluci plasmidové DNA.

Pro zvýšení koncentrace eluované DNA může být objem elučního pufru snížen na 0,25 ml. Mějte ale na paměti, že nižší objem elučního pufru sníží celkový výnos DNA. Chcete-li zvýšit celkový výtěžek DNA o 20 - 30%, proveďte další eluci pomocí pufru (0,15 ml).

10. Vyhoďte purifikační kolonku. Použijte purifikovanou plasmidovou DNA v následných aplikacích nebo uskladněte DNA při teplotě -20 °C.

 

3) GeneJET Plasmid Maxiprep Kit

GeneJET Plasmid Maxiprep Kit využívá technologii založenou na silikagelových membránách ve formě pohodlných kolonek. Každá purifikace poskytuje až 750 ug vysoce kopiové plasmidové DNA. Čistá plasmidová DNA může být rovněž použita v mnoha procesech molekulární biologie, například při štěpení restrikčními endonukleázami, PCR, klonování, transformace, automatizované sekvenování, in vitro transkripce a transfekce robustních buněčných linií.

Výhody Maxiprep kitu:

  • efektivní - vysoké výtěžky až 750 ug vysoce kvalitní plasmidové DNA z 250 ml bakteriální kultury
  • vysoká koncentrace čisté DNA - > 400 ng / ul
  • pohodlný - formát kolonek, centrifugační nebo vakuové protokoly
  • rychlý - celý postup trvá 60 minut, je podstatně rychlejší než použití kolonek s gravitačním průtokem

Možnosti využití kitu:

Vznikláou plasmidovou DNA využijete pro všechny běžné aplikace molekulární biologie, především pak při štěpení restrikčním enzymem FastDigest, automatizovaném fluorescenčním sekvenování, PCR, klonování, transformaci, in vitro transkripci a transfekci robustních buněčných liní.

Protokoly k GeneJET Plasmid Midiprep kitu

GeneJET Plasmid Maxiprep Kit poskytuje optimalizované protokoly pro purifikaci plasmidové DNA s použitím nízkorychlostní (až 5 000 × g) a vysokorychlostní (až 48 000 × g) centrifugy, a také s použitím vakuového kolektoru.

A) Purifikace plasmidové DNA s použitím NÍZKORYCHLOSTNÍ CENTRIFUGY
1. Vypěstujte až 250 ml bakteriální kultury s OD600 = 2 - 3. Pro dosažení nejlepších výsledků vypočtěte maximální možný objem buněčné kultury.Maximální objem kultury (ml) = 750/OD600. Sklizeň buněk proveďte centrifugací po dobu 10 minut při 5 000 x g. Odstraňte supernatant.
2. Rozpusťte peletu buněk v 6 ml Resuspension Solution. Bakteriální pelety by měly být resuspendovány votexováním nebo pipetováním nahoru a dolů, dokud nejsou viditelné žádné buněčné shluky.Ujistěte se, že RNase A Solution byl přidán do roztoku, jak je popsáno v manuálu.
3. Přidejte 6 ml Lysis Solution a jemně promíchejte převracením zkumavky 4 - 6krát, dokud roztok nebude viskózní a lehce průhledný. Inkubujte po dobu 3 minut při pokojové teplotě.Nevortexujte, abyste zabránili lámání chromozomální DNA. Neinkubujte déle než 3 min, abyste zabránili denaturaci nadšroubovicové plasmidové DNA.
4. Přidejte 6 ml Neutralization Solution a okamžitě promíchejte převracením zkumavky 5 - 8krát.X
5. Přidejte 0,8 ml Endotoxin Binding Reagent. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5- 8 krát. Inkubujte po dobu 5 minut při pokojové teplotě.Po přidání neutralizačního roztoku a Endotoxin Binding Reagent je důležité, aby míchání bylo jemné, ale důkladné, abyste zabránili lokálnímu vysrážení bakteriálního buněčného odpadu. Neutralizovaný bakteriální lyzát by měl být zakalený s obsahem bílé sraženiny.
6. Přidejte 6 ml 96% ethanolu. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5 - 6 krát.X
7. Centrifugujte 40 minut při 4 000-5 000 × g. Takto shromáždíte buněčný debris a chromozomální DNA.Pokud upřednostňujete vakuový systém, pokračujte v protokolu určeném pro tento typ purifikace. Používejte pouze doporučenou rychlost centrifugace.
8. Přeneste supernatant do 50 ml zkumavky (není součástí kitu) dekantací, nebo pipetováním. Vyhněte se porušení nebo přenosu bílé sraženiny. Přidejte 6 ml 96% ethanolu. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5 - 6 krát.X
9. Přeneste část vzorku (~ 20 ml) na kolonku. Dávejte pozor, abyste kolonku nepřeplnili. Centrifugujte 3 min při 2 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.

Po použití pečlivě (těsně) uzavřete sáček s kolonkami!

10. Opakujte krok 9 a zpracujte veškerý zbývající lyzát.

X
11. Přidejte 8 ml Wash Solution I (zředěný s isopropanolem, jak je popsáno v manuálu). Centrifugujte po dobu 2 min. při 3 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.X
12. Přidejte 8 ml Wash Solution II (zředěný s ethanolem, jak je popsáno v manuálu) Centrifugujte po dobu 2 min. při 3000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.X
13. Opakujte promytí kolonky Wash Solution II (krok 12).X
14. Centrifugujte po dobu 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru pro odstranění zbytků promývacího roztoku. Odstraňte sběrnou zkumavku s protečeným roztokem.X
15. Přeneste kolonku do nové 50ml zkumavky (v kitu). Přidejte 1 ml Elution Buffer do středu kolonky. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru pro eluci plasmidové DNA.Pro zvýšení koncentrace eluované DNA může být objem elučního pufru snížen na 0,25 ml. Mějte ale na paměti, že nižší objem elučního pufru sníží celkový výnos DNA. Chcete-li zvýšit celkový výtěžek DNA o 20 - 30%, proveďte další eluci pomocí pufru (0,15 ml).
16. Vyhoďte purifikační kolonku. Použijte purifikovanou plasmidovou DNA v následných aplikacích nebo uskladněte DNA při teplotě -20 °C.X
B) Purifikace plasmidové DNA s použitím VYSOKORYCHLOSTNÍ CENTRIFUGY
1. Vypěstujte až 250 ml bakteriální kultury s OD600 = 2 - 3. Pro dosažení nejlepších výsledků vypočtěte maximální možný objem buněčné kultury.Maximální objem kultury (ml) = 750/OD600. Sklizeň buněk proveďte centrifugací po dobu 10 minut při 5 000 x g. Odstraňte supernatant.
2. Rozpusťte peletu buněk v 6 ml Resuspension Solution. Bakteriální pelety by měly být resuspendovány votexováním nebo pipetováním nahoru a dolů, dokud nejsou viditelné žádné buněčné shluky.Ujistěte se, že RNase A Solution byl přidán do roztoku, jak je popsáno v manuálu.
3. Přidejte 6 ml Lysis Solution a jemně promíchejte převracením zkumavky 4 - 6krát, dokud roztok nebude viskózní a lehce průhledný. Inkubujte po dobu 3 minut při pokojové teplotě.Nevortexujte, abyste zabránili lámání chromozomální DNA. Neinkubujte déle než 3 min, abyste zabránili denaturaci nadšroubovicové plasmidové DNA.

4. Přidejte 6 ml Neutralization Solution a okamžitě promíchejte převracením zkumavky 5 - 8krát.

X
5. Přidejte 0,8 ml Endotoxin Binding Reagent. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5 - 8 krát. Inkubujte po dobu 5 minut při pokojové teplotě.Po přidání neutralizačního roztoku a Endotoxin Binding Reagent je důležité, aby míchání bylo jemné, ale důkladné, abyste zabránili lokálnímu vysrážení bakteriálního buněčného odpadu. Neutralizovaný bakteriální lyzát by měl být zakalený a obsahovat bílou sraženinu.
6. Centrifugujte 20 minut při 20 000 rpm (48 000 × g) a tak se shromáždí buněčný debris a chromozomální DNA.
7. Přeneste supernatant do 50 ml zkumavky (není součástí kitu) dekantací, nebo pipetováním. Vyhněte se porušení nebo přenosu bílé sraženiny. Přidejte 6 ml 96% ethanolu. Ihned promíchejte převracením zkumavky 5 - 6 krát.X
8. Přeneste část vzorku (~ 20 ml) na kolonku. Dávejte pozor, abyste kolonku nepřeplnili. Centrifugujte 3 min při 2 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.Po použití pečlivě (těsně) uzavřete sáček s kolonkami!

9. Opakujte krok 8 a zpracujte veškerý zbývající lyzát.

X

10. Přidejte 8 ml Wash Solution I (zředěný s isopropanolem, jak je popsáno v manuálu). Centrifugujte po dobu 2 min. při 3 000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.

X
11. Přidejte 8 ml Wash Solution II (zředěný s ethanolem, jak je popsáno v manuálu) Centrifugujte po dobu 2 min. při 3000 × g v kyvetovém rotoru. Odstraňte protečený roztok a umístěte kolonku zpět do stejné zkumavky.X

12. Opakujte promytí kolonky Wash Solution II (krok 11).

X

13. Centrifugujte po dobu 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru pro odstranění zbytků promývacího roztoku. Odstraňte sběrnou zkumavku s protečeným roztokem.

X

14. Přeneste kolonku do nové 50 ml zkumavky (v kitu). Přidejte 1 ml Elution Buffer do středu kolonky. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte po dobu 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru pro eluci plasmidové DNA.

15. Vyhoďte purifikační kolonku. Použijte purifikovanou plasmidovou DNA v následných aplikacích nebo uskladněte DNA při teplotě -20 °C.

X

C) Purifikace plasmidové DNA s použitím VAKUOVÉHO SYSTÉMU

1. Proveďte sběr buněk, lýzu a zpracování lyzátu podle kroků 1-8 v protokolu A nebo kroků 1-7 v protokolu B.X
2. Připravte si vakuový systém podle pokynů dodavatele. Umístěte GeneJET Maxi
purifikační kolonku do systému.
X
3. Přeneste část vzorku (~ 20 ml) na kolonku. Dávejte pozor, abyste kolonku nepřeplnili. Aplikujte vakuum, aby roztok protekl skrz kolonku. Vypněte vakuum, když projde veškerý roztok.Po použití pečlivě (těsně) uzavřete sáček s kolonkami!

4. Opakujte krok 3 a zpracujte veškerý zbývající lyzát.

X
5. Přidejte 8 ml Wash Solution I (zředěný s isopropanolem, jak je popsáno v manuálu). Aplikujte vakuum, aby roztok protekl skrz kolonku. Jakmile projde veškerý roztok, vypněte vakuum.X
6. Přidejte 8 ml Wash Solution II (zředěný s ethanolem, jak je popsáno v manuálu) Aplikujte vakuum, aby roztok protekl skrz kolonku. Jakmile projde veškerý roztok, vypněte vakuum.X

7. Opakujte promytí kolonky Wash Solution II (krok 6).

X

8. Pro vysušení kolonky aplikujte vakuum po dobu 10 minut, nebo přeneste kolonku do nové 50 ml sběrné zkumavky a centrifugujte 5 minut při 3 000 × g v kyvetovém rotoru.

X

9. Přeneste kolonku do nové 50 ml zkumavky (v kitu). Přidejte 1 ml Elution Buffer do středu kolonky. Inkubujte po dobu 2 minut při pokojové teplotě a centrifugujte

Pro zvýšení koncentrace eluované DNA může být objem elučního pufru snížen na 0,25 ml. Mějte ale na paměti, že nižší objem elučního pufru sníží celkový výnos DNA. Chcete-li zvýšit celkový výtěžek DNA o 20 - 30%, proveďte další eluci pomocí pufru (0,15 ml).

10. Vyhoďte purifikační kolonku. Použijte purifikovanou plasmidovou DNA v následných aplikacích nebo uskladněte DNA při teplotě -20 °C.

X
Nahoru