Pracovní postup izolace cell-free DNA plodu z mateřské krve

Izolace cell-free DNA (cfDNA) z mateřské krve se stala klíčovou metodou v oblasti neinvazivní prenatální diagnostiky. Tento protokol poskytuje ucelený návod, jak správně získat a zpracovat vzorek plazmy tak, aby bylo možné detekovat přítomnost cfDNA plodu s vysokou spolehlivostí. Díky tomu lze následně provádět analýzy pohlaví plodu, detekci genetických poruch či chromozomálních aberací bez nutnosti invazivních zásahů.

Následující pracovní postup kombinuje ověřené laboratorní techniky, doporučené materiály a osvědčené postupy výrobců včetně praktických rad od odborníka Genia z Biogen Praha. Protokol je navržen tak, aby byl co nejjednodušší na použití, ale zároveň dostatečně robustní pro rutinní použití v laboratorní praxi.

Materiál potřebný k izolaci:

  • Zkumavky pro odběr krve (např. Cell-Free DNA BCT od Streck)

  • Centrifuga (např. Eppendorf 5810R nebo podobná chlazená centrifuga – osvědčená a běžně používaná v laboratořích)

  • Pipety a špičky (s filtry)

  • Izolační kit na cfDNA (např. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit nebo alternativně MagBio cfKapture Kit využívající magnetické kuličky, vhodný i pro automatizované platformy)

  • Zkumavky a stojánky

  • Vortex

  • Teplotní blok nebo vodní lázeň

                                         

Postup (ověřený a doporučený výrobci a odborníky):

  1. Odběr vzorku

    • Odeberte 8–10 ml periferní žilní krve matky do stabilizační zkumavky (např. Cell-Free DNA BCT od Streck).

    • Jemně promíchejte převracením 8–10x (netřepat!).

  2. Centrifugace 1 (oddělení plazmy)

    • Krev centrifugujte při 1600 g, 10 minut při 4 °C.

    • Opatrně odeberte plazmu do nové čisté zkumavky (pozor, nenarušte buněčnou vrstvu!).

  3. Centrifugace 2 (odstranění buněčných nečistot)

    • Odebranou plazmu centrifugujte podruhé při 16 000 g, 10 minut při 4 °C.

    • Získanou čistou plazmu přeneste pipetou do nové čisté zkumavky.

  4. Izolace cfDNA pomocí kitu

    • Postupujte dle návodu výrobce kitu (např. QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit nebo MagBio cfKapture Kit).

    • Obecně se jedná o přidání vazebného pufru, inkubaci vzorku na koloně (nebo s magnetickými částicemi), promytí a následnou eluci.

  5. Eluce a uchovávání cfDNA

    • CfDNA eluujte v objemu doporučeném výrobcem (obvykle 20–50 µl elučného pufru).

    • Vzorek uchovávejte při teplotě -20 °C (krátkodobě) nebo -80 °C (dlouhodobě).

    • Doporučuje se kontrola kvality pomocí Bioanalyzeru nebo TapeStation (Agilent) pro ověření velikosti a integrity fragmentů cfDNA.

 

 

Tipy pro úspěšnou izolaci:

  • Pracujte šetrně, vyvarujte se intenzivního třepání vzorků.

  • Dodržujte přesně doporučené rychlosti centrifugace a teploty.

  • Používejte pipety se špičkami opatřenými filtry k prevenci kontaminace.

Pokud máte po eluci málo cfDNA, vyzkoušejte eluci v menším objemu (např. 20 µl) nebo použijte dvoukolonovou purifikaci pro koncentrovanější výstup.

Řešení problémů při nízkém výtěžku cfDNA:

  • Zvyšte počáteční objem krve pro odběr (až na 10–20 ml).

  • Zvažte snížení objemu eluce pro zvýšení koncentrace DNA (např. eluovat ve 20 µl místo 50 µl).

  • Minimalizujte čas mezi odběrem a izolací cfDNA, ideálně do 4 hodin.

  • Zkontrolujte účinnost centrifugace, případně zvyšte rychlost nebo dobu centrifugace podle doporučení výrobce kitu.

Před samotnou PCR nebo NGS vždy zkontrolujte integritu fragmentů cfDNA pomocí Bioanalyzeru. Předejdete tím ztrátám času a reagentů.

Jak ověřit úspěšnou izolaci cfDNA plodu:

  • Proveďte analýzu pomocí kvantitativní PCR (qPCR) nebo digitální PCR (dPCR) zaměřenou na specifické markery plodu (např. chromozom Y pro mužský plod nebo SNP markery specifické pro plod).

  • Použijte fragmentační analýzu k ověření velikosti fragmentů cfDNA (cfDNA plodu má typicky fragmenty kratší než mateřská cfDNA).

  • Minimální doporučená koncentrace cfDNA pro úspěšnou qPCR je 0,1–1 ng/µl (zdroj: QIAGEN, Tech Note 2021).

Doporučené primery a sondy pro ověření cfDNA plodu (ověřené a používané v odborné praxi):

  • Pro mužský plod (chromozom Y):

    • Primer forward: 5'-CAT CCA GAG CGT CCC TGG-3'

    • Primer reverse: 5'-TTT GTA GTG TCG GTG TCC G-3'

    • Sonda: 5'-(FAM)-TCC TCC AGC TCC AGC CAC CAG-(TAMRA)-3'
      (Zdroj: Lo et al., Lancet 1997; QIAGEN tech data)

  • Pro obecné SNP markery specifické pro plod:

    • Příklad primerů a sondy pro SNP rs4680 (COMT gen):

      • Primer forward: 5'-GCC TGT GCT CAC CTG TGA-3'

      • Primer reverse: 5'-AGG GCC TTC CAG GTA TGC-3'

      • Sonda: 5'-(VIC)-TGG AGG ACG TTG TGG-(MGBNFQ)-3'
        (Zdroj: Thermo Fisher TaqMan Assay Database)

  • Služba návrhu a syntézy primerů/sond:

    • Návrh a syntézu specifických primerů a sond lze zadat firmě GENEWIZ (Azenta Life Sciences), která nabízí odborné služby a konzultace v oblasti qPCR a detekce cfDNA. Rádi Vám s ní pomůžeme, firmu zastupujeme.

  • Alternativní ověření (NGS):

    • Metoda Next-Generation Sequencing umožňuje komplexní analýzu cfDNA bez nutnosti specifických primerů a sond.

    • Pokud má laboratoř vlastní přístroj NGS, doporučuje se využít validovaný interní workflow zahrnující přípravu knihoven (např. s použitím enzymatického fragmentování a adaptérů kompatibilních s Illumina), následnou sekvenaci a bioinformatické zpracování dat (např. zaměřené na detekci chromozomálních aberací nebo přítomnosti plodových SNP).

    • V případě potřeby externí služby lze sekvenační analýzu a interpretaci zadat firmě GENEWIZ, která nabízí i NGS analýzy vhodné pro cfDNA. Rádi Vám s ní pomůžeme, firmu zastupujeme.

    • Výhody NGS: Vyšší citlivost a specifita, komplexní genetická informace.

    • Nevýhody NGS: Vyšší cena, nutnost specializovaného vybavení a zkušeností s interpretací výsledků.

Ověřené zdroje a literatura:

  • Položky označené hvězdičkou (*) jsou povinné.
ANCHOR_TOP_TITLE

Tento web využívá cookies

Pro chod webu jsou nezbytně aktivovány esenciální soubory cookies. Pro plnohodnotné poskytování služeb, personalizaci reklam a analýzu návštěvnosti jsou však nutné povolit i volitelné cookies. Kliknutím na následující tlačítko, je zapnete. Zobrazit podrobnosti
Odmítnout vše Nastavení Povolit vše

Nastavení cookies

Vaše soukromí je důležité. Můžete si vybrat z nastavení cookies níže. Zobrazit podrobnosti

Potvrdit vše Potvrdit moje volby