Podrobný návod na rychlé a účinné klonování. Také vám pomůžeme připravit roztoky důležité při této práci.
Hledaný výraz musí mít více jak 2 znaky.
Podrobný návod na rychlé a účinné klonování. Také vám pomůžeme připravit roztoky důležité při této práci.
Klonování probíhá ve 3 fázích:
InsTAclone PCR Cloning Kit skýtá výhody enzymu Taq DNA polymerázy, konkrétně její terminální transferázové aktivity. Tato rodina enzymů přidává po jednom adeninu na každý konec PCR produktu a vznikají tak přesahující 3´ zakončení. Linearizovaný vektor pTZ57R/T, který je součástí systému, je oproti tomu na jednom z konců završen 3’-ddT. Vznikají kohézní konce podporující ligaci vektoru a fragmentu - tedy přímé vložení modifikovaného PCR produktu.
Zakončení s přidaným adeninem enhancují ligaci a také brání v opětné cirkulaci (znovu uzavření rozštěpeného vektoru), urychlují tak celé klonování. To se v konečném důsledku projeví jako více než 90% úspěšnost transformace a ze všech klonů je právě přes 90 % rekombinantních klonů s vektorem, který obsahuje insertovanou sekvenci. Tyto klony jsou odlišovány od ostatních metodou blue/right, jež detekuje mutaci lacZΔM15.
Aby byl výsledný produkt vyhovující, je nutné používat při PCR zásadně Taq DNA polymerázu či jí podobné. Jestliže není při PCR reakci použita tzv. proofreading polymeráza (enzym s opravnou funkcí), PCR produkt má zakončení, která nejsou kompatibilní s linearizovaným vektorem pTZ57R/T a takový produkt je nevhodný pro ligaci a klonování tímto systémem. Další možností je systém CloneJET PCR Cloning Kit.
Upozornění! Ligace purifikovaných DNA fragmentů a vektoru pTZ57R/T je optimální při poměru 3:1. Jestliže nebyl PCR produkt přečištěn (purifikován), není vhodné ho do ligační směsi přidávat více než v objemu 4 μl. Jinak by takto přidané soli bránily ligaci. Soli totiž inhibují T4 DNA ligázu a její aktivitu už snižují soli, které jsou přítomny v PCR reakčním pufru.
5x reakční pufr | 6 μl |
PCR produkt (0.52 pmol výsledná c) | objem variabilní (ne > než 4 μl) |
pTZ57R/T Vector (55 ng/μl) | 3 μl (0.17 pmol) |
T4 DNA ligáza | 1 μl |
Sterilní voda, nuclease-free | doplnit do 29 μl |
TransformAid Bacterial Transformation Kit zajišťuje rychlou a současně flexibilní přípravu kompetentních buněk a efektivní transformaci (s účinností 107 tranformací na 1 μg plasmidové DNA). Příprava kompetentních buněk, do nichž je posléze transformován rekombinantní vektor, může probíhat přes noc v roztoku, který je součástí kitu, nebo na agarových plotnách (2,5 hodiny). Buňky E. Coli nejsou součástí kitu, ale využít můžete všechny běžné laboratorní kmeny E. coli. Rozlišování je založeno na detekování mutace lacZΔM15, a to metodou blue/right. Tomu vyhovují například XL1-Blue, ER1727, JM109 a další.
Díky noční inkubaci nevyžaduje bakteriální kultura další úpravy. Následné zpracování vzorku je rychlé. Příprava buněk těsně před transformací trvá 50 minut, transformace 5 minut a přímé nanesení na předehřáté plotny s LB-ampicilinem a X-Gal/IPTG, kde jsou buňky inkubovány za teploty 37° C přes noc. Jednotlivé kroky analýzy by měly kontinuálně navazovat, protože při skladování v -70° C dochází ke snižování kvality získaných klonů, což by mohlo ovlivnit výsledky dalších analýz. Zamražení proto není doporučováno.
Doporučení: Všechny vykonané práce by měly být prováděny na ledu. Krátce centrifugovat je možné za laboratorní teploty ve standardní mikrocentrifuze, avšak buňky by neměly zůstat při této teplotě déle než 5 minut.
Den před transformací je potřeba naočkovat 2 ml C-media čerstvě odebraným vzorkem dané bakteriální kultury (ne starší než 10 dní) a inkubovat tubu s médiem a vzorkem za třepání a teploty 37° C přes noc. Alespoň 20 minut před samotnou transformací musí být tuby s C-médiem zahřáty na 37° C (1,5 ml na každé dvě 2 transformace), stejně tak alespoň 20 minut před nanesením inkubované kultury je nutné zahřívat LB-agar plotny s ampicilinem, X-Gal a IPTG (rovněž při třepání a 37° C) a připravit T-solution, který vyžaduje chlazení na ledu a obsahuje 250 μl roztoku T-solution (A) plus 250 μl T-solution (B).
Den před transformací je potřeba naočkovat 2 ml C-media čerstvě odebraným vzorkem dané bakteriální kolonie (ne starší než 10 dní) a inkubovat tubu s médiem a vzorkem za třepání a teploty 37° C přes noc. Alespoň 20 minut před samotnou transformací musí být tuby s C-médiem zahřáty na 37° C (1,5 ml na každé dvě 2 transformace), stejně tak alespoň 20 minut před nanesením inkubované kolonie je nutné zahřívat LB-agar plotny s ampicilinem, X-Gal a IPTG (rovněž při třepání a 37° C) a připravit T-solution, který vyžaduje chlazení na ledu a obsahuje 250 μl roztoku T-solution (A) plus 250 μl T-solution (B).
Doporučení: Je-li potřeba více kompetentních buněk, postup je stejný, ale objemy jsou větší a podmínky centrifugace jsou dány následovně: krok 2 a 4, centrifugace při 5 tis. – 10 tis. g, 5 minut, 4° C.
K rozlišení kolonií se používá systém blue/white selekce. Bakterie totiž ne vždy přijímají nabízený plasmid, který tento cílový segment DNA obsahuje. Bakterie, které přijaly plasmid bez inkorporovaného segmentu DNA, se projevují modře. Naopak bílé kolonie představují bakterie, které přijaly plasmid s rekombinantní molekulou DNA. Bílé kolonie jsou cílové pro následné analýzy.
V rámci průběžné kontroly (screeningu) potvrdí metoda PCR inserci požadovaného fragmentu pouze u DNA úseků kratších než 3 kb. Pro segmenty delší je vhodné přítomnost cizorodé DNA sledovat spíše restrikční analýzou.
10x Taq pufr | 2 μl | |
dNTPs mix (2 mM, každý) | 2 μl | |
MgCl2, 25 mM | 1.2 μl | |
Primery (M13/pUC) každý | 0.6 μl | |
Taq DNA polymeráza, 5U/ μl nebo DreamTaq Green DNA polymeráza | 0.1 μl | |
PCR Master Mix (2x) nebo DreamTaq Green-PCR Master mix |
| |
sterilní voda, nuclease-free | doplnit do 20 μl |
94° C / 2min | jednou |
94° C / 30 s | 30 cyklů |
45° C / 30 s | |
72° C / 1 min |
Doporučení: Je vhodné amplifikovaný úsek dále zpracovat ihned po PCR reakci, nebo zamrazit a skladovat při -20° C, použijte vždy čerstvý elektroseparační pufr a minimalizujte dobu detekce UV zářením. Jinak dochází k degradaci vzorků.
10x Taq pufr | - |
dNTPs mix (2 mM, každý) | - |
MgCl2, 25 mM | - |
Primery (M13/pUC) každý | 0.6 μl |
Taq DNA polymeráza, 5U/ μl nebo DreamTaq Green DNA polymeráza | - |
PCR Master Mix (2x) nebo DreamTaq Green-PCR Master mix | 10 μl |
sterilní voda, nuclease-free | doplnit do 20 μl |
Dále postupujte jako při analýze metodou PCR.
Pro přesnou práci jsme pro vás připravili také předpisy a protokoly pro přípravu roztoků: