Klonování TA systémem pomocí InsTAclone PCR klonovacího kitu

Proč je výhodné klonovat pomocí InsTAclone PCR klonovacího kitu?

InsTAclone PCR Cloning Kit skýtá výhody enzymu Taq DNA polymerázy, konkrétně její terminální transferázové aktivity. Tato rodina enzymů přidává po jednom adeninu na každý konec PCR produktu a vznikají tak přesahující 3´ zakončení. Linearizovaný vektor pTZ57R/T, který je součástí systému, je oproti tomu na jednom z konců završen 3’-ddT. Vznikají kohézní konce podporující ligaci vektoru a fragmentu - tedy přímé vložení modifikovaného PCR produktu.

Zakončení s přidaným adeninem enhancují ligaci a také brání v opětné cirkulaci (znovu uzavření rozštěpeného vektoru), urychlují tak celé klonování. To se v konečném důsledku projeví jako více než 90% úspěšnost transformace a ze všech klonů je právě přes 90 % rekombinantních klonů s vektorem, který obsahuje insertovanou sekvenci. Tyto klony jsou odlišovány od ostatních metodou blue/right, jež detekuje mutaci lacZΔM15.

Jak postupovat při klonování

• Nastudujte celý manuál s pracovním protokolem ještě před začátkem práce a obdobně sestavte vlastní postup klonování pro konkrétní DNA vzorky.
• Do laminárního boxu je potřeba před každou prací připravit všechen materiál a pomůcky k analýze. Zmražené látky nechte za laboratorní teploty rozmrazit (případně držte na ledu), připravte zásobní, eventuálně pracovní roztoky, a zajistěte dostatek ledu na chlazení.

1. LIGACE

Aby byl výsledný produkt vyhovující, je nutné používat při PCR zásadně Taq DNA polymerázu či jí podobné. Jestliže není při PCR reakci použita tzv. proofreading polymeráza (enzym s opravnou funkcí), PCR produkt má zakončení, která nejsou kompatibilní s linearizovaným vektorem pTZ57R/T a takový produkt je nevhodný pro ligaci a klonování tímto systémem. Další možností je systém CloneJET PCR Cloning Kit.

Upozornění! Ligace purifikovaných DNA fragmentů a vektoru pTZ57R/T je optimální při poměru 3:1. Jestliže nebyl PCR produkt přečištěn (purifikován), není vhodné ho do ligační směsi přidávat více než v objemu 4 μl. Jinak by takto přidané soli bránily ligaci. Soli totiž inhibují T4 DNA ligázu a její aktivitu už snižují soli, které jsou přítomny v PCR reakčním pufru.

• Ligační reakci vyhovují PCR produkty, které jsou kratší než 1 kb a mají na gelu jeden čistý band v odpovídající zóně (nemusí být čištěny/purifikovány). V takovém případě je ale důležité, nepřekračovat objem 4 μl do reakce.
• V roztoku mohou být přítomny i primery-dimery a další nespecifické produkty, které nemusí být na gelu viditelné, ale mohou ovlivnit některé reakce během klonování. Potenciální riziko výskytu lze rovněž minimalizovat gelovou purifikací.

Protokol pro 1 produkt:

1. Do popsané 0,2 μl zkumavky připravte na ledu následující reakční směs o celkovém objemu 30 μl. Takto připravenou směs krátce vortexovat a centrifugovat 3 – 5 s.

   5x reakční pufr	6 μl
   PCR produkt (0.52 pmol výsledná c)	objem variabilní (ne > než 4  μl)
   pTZ57R/T Vector (55 ng/μl)	3 μl (0.17 pmol)
   T4 DNA ligáza	1 μl
   Sterilní voda, nuclease-free	doplnit do 29 μl

2. Reakční směs inkubujte 5 minut při laboratorní teplotě (cca 22° C) 1 hodinu. Doporučení: Pro maximální výtěžek je vhodné provádět ligaci přes noc při teplotě 4° C. Při používání sady TransformAid Bacterial Transformation Kit jsou během ligace paralelně připravovány kompetentní buňky E. Coli, což zkracuje dobu mezi PCR a transformací, a je tak urychlena ligace i celý proces klonování. Je-li analýza založena na metodě blue/white, je nutné klonovat v bakteriálních kmenech E. Coli s mutací lacZΔM15. Následné analýze vyhovují například kmeny XL1-Blue, ER1727, JM109 a další. Rozlišení kultivovaných buněk by totiž jinak nebylo možné.
3. Použijte 2.5 μl této inkubované směsi přímo k transformaci do buněk bakteriálních kultivací kultivovaných přes noc, nebo do buněk bakteriálních kolonií kultivovaných 2,5 hodiny v den transformování. V případě, že nebude směs záhy dále zpracována, je možné ji v této fázi zamrazit a skladovat při teplotě -20° C. Před použitím je třeba směs rozmrazit za laboratorní teploty (případně na ledu) a opatrně promíchat, nejlépe převracením mikrozkumavky dnem vzhůru, tam a zpět
   .

2. TRANSFORMACE

TransformAid Bacterial Transformation Kit zajišťuje rychlou a současně flexibilní přípravu kompetentních buněk a efektivní transformaci (s účinností 10⁷ tranformací na 1 μg plasmidové DNA). Příprava kompetentních buněk, do nichž je posléze transformován rekombinantní vektor, může probíhat přes noc v roztoku, který je součástí kitu, nebo na agarových plotnách (2,5 hodiny). Buňky E. Coli nejsou součástí kitu, ale využít můžete všechny běžné laboratorní kmeny E. coli. Rozlišování je založeno na detekování mutace lacZΔM15, a to metodou blue/right. Tomu vyhovují například XL1-Blue, ER1727, JM109 a další.

Díky noční inkubaci nevyžaduje bakteriální kultura další úpravy. Následné zpracování vzorku je rychlé. Příprava buněk těsně před transformací trvá 50 minut, transformace 5 minut a přímé nanesení na předehřáté plotny s LB-ampicilinem a X-Gal/IPTG, kde jsou buňky inkubovány za teploty 37° C přes noc. Jednotlivé kroky analýzy by měly kontinuálně navazovat, protože při skladování v -70° C dochází ke snižování kvality získaných klonů, což by mohlo ovlivnit výsledky dalších analýz. Zamražení proto není doporučováno.

Doporučení: Všechny vykonané práce by měly být prováděny na ledu. Krátce centrifugovat je možné za laboratorní teploty ve standardní mikrocentrifuze, avšak buňky by neměly zůstat při této teplotě déle než 5 minut.

• Transformace bakteriální kultury

Den před transformací je potřeba naočkovat 2 ml C-media čerstvě odebraným vzorkem dané bakteriální kultury (ne starší než 10 dní) a inkubovat tubu s médiem a vzorkem za třepání a teploty 37° C přes noc. Alespoň 20 minut před samotnou transformací musí být tuby s C-médiem zahřáty na 37° C (1,5 ml na každé dvě 2 transformace), stejně tak alespoň 20 minut před nanesením inkubované kultury je nutné zahřívat LB-agar plotny s ampicilinem, X-Gal a IPTG (rovněž při třepání a 37° C) a připravit T-solution, který vyžaduje chlazení na ledu a obsahuje 250 μl roztoku T-solution (A) plus 250 μl T-solution (B).

Protokol pro 2 transformace:

1. Přidejte 150 μl bakteriální kultury po noční kultivaci k 1.5 ml ohřátého C-média. Inkubujte 20 minut při třepání a teplotě 37° C.
2. Směs centrifugujte 1 minutu, po té zpracujte pelety a odstraňte supernatant.
3. Resuspendujte pelet, respektive buňky v něm, ve 300 μl roztoku T-solution. Inkubujte na ledu 5 minut.
4. Centrifugujte 1 minutu a opět odstraňte supernatant.
5. Resuspendujte buňky ve 120 μl roztoku T-solution. Inkubujte 5 minut na ledu.
6. Přidejte 2.5 μl ligační směsi s cca 14 ng DNA vektoru, nebo 1 μl směsi s kontrolní DNA (10-100 pg). 2 minuty nechte odstát na ledu.
7. Vpravte 50 μl takto ošetřených buněk do každé zkumavky s konkrétní DNA (PCR produktem), promíchejte a inkubujte 5 minut na ledu.
8. Klonovanou směs v okamžitém sledu umístěte na předehřátou LB-ampicilin X-Gal/IPTG agar plotnu a inkubujte přes noc při 37° C.

• Transformace bakteriální kolonie

Den před transformací je potřeba naočkovat 2 ml C-media čerstvě odebraným vzorkem dané bakteriální kolonie (ne starší než 10 dní) a inkubovat tubu s médiem a vzorkem za třepání a teploty 37° C přes noc. Alespoň 20 minut před samotnou transformací musí být tuby s C-médiem zahřáty na 37° C (1,5 ml na každé dvě 2 transformace), stejně tak alespoň 20 minut před nanesením inkubované kolonie je nutné zahřívat LB-agar plotny s ampicilinem, X-Gal a IPTG (rovněž při třepání a 37° C) a připravit T-solution, který vyžaduje chlazení na ledu a obsahuje 250 μl roztoku T-solution (A) plus 250 μl T-solution (B).

Protokol pro 2 transformace:

1. K 1.5 ml předehřátého C-média přidejte čerstvě odebrané kultivované bakteriální kolonie o velikosti 4x4 mm, opatrně promíchejte a inkubujte 2 hodiny za třepání a 37° C.
2. Směs centrifugujte 1 minutu, poté zpracujte pelet a odstraňte supernatant.
3. Resuspendujte pelet, respektive buňky v něm, ve 300 μl roztoku T-solution. Inkubujte na ledu 5 min.
4. Centrifugujte 1 minutu a opět odstraňte supernatant.
5. Resuspendujte buňky ve 120 μl roztoku T-solution. Inkubujte 5 minut na ledu.
6. Přidejte 2.5 μl ligační směsi s cca 14 ng DNA vektoru, nebo 1 μl směsi s kontrolní DNA (10-100 pg). 2 minuty nechte odstát na ledu.
7. Vpravte 50 μl takto ošetřených buněk do každé zkumavky s konkrétní DNA (PCR produktem), promíchejte a inkubujte 5 minut na ledu.
8. Klonovanou směs v okamžitém sledu umístěte na předehřátou LB-ampicilin X-Gal/IPTG agar plotnu a inkubujte přes noc při 37° C.

Doporučení: Je-li potřeba více kompetentních buněk, postup je stejný, ale objemy jsou větší a podmínky centrifugace jsou dány  následovně: krok 2 a 4, centrifugace při 5 tis. – 10 tis. g, 5 minut, 4° C.

3. Analýza

K rozlišení kolonií se používá systém blue/white selekce. Bakterie totiž ne vždy přijímají nabízený plasmid, který tento cílový segment DNA obsahuje. Bakterie, které přijaly plasmid bez inkorporovaného segmentu DNA, se projevují modře. Naopak bílé kolonie představují bakterie, které přijaly plasmid s rekombinantní molekulou DNA. Bílé kolonie jsou cílové pro následné analýzy.

• Analýza metodou PCR

V rámci průběžné kontroly (screeningu) potvrdí metoda PCR inserci požadovaného fragmentu pouze u DNA úseků kratších než 3 kb. Pro segmenty delší je vhodné přítomnost cizorodé DNA sledovat spíše restrikční analýzou.

Protokol pro 1 produkt:

1. Připravte dostatečné množství reakční směsi (master mixu) pro PCR reakci dle rozpisu, a to pro všechny vyšetřované vzorky (tj. 20 μl master mixu každý vzorek):

   10x Taq pufr	2 μl
   dNTPs mix (2 mM, každý)	2 μl
   MgCl2, 25 mM	1.2 μl
   Primery (M13/pUC) každý	0.6 μl
   Taq DNA polymeráza, 5U/ μl nebo DreamTaq Green DNA polymeráza	0.1 μl
   PCR Master Mix (2x) nebo DreamTaq Green-PCR Master mix	-
   sterilní voda, nuclease-free	doplnit do 20 μl

2. Směs dobře promíchejte, rozpipetujte po 20 μl do předem připravených mikrozkumavek a ty držte na ledu.
3. Jednotlivé kolonie resuspendujte se směsí v odpovídajících mikrozkumavkách (pro každý vzorek 1 zkumavka, nebo více paralel).
4. Po krátké chvíli zavřené mikrozkumavky vložte do termocykleru a spusťte patřičný program. Pro PCR je to:

   94° C / 2min	jednou
   94° C / 30 s	30 cyklů
   45° C / 30 s
   72° C / 1 min

5. Po ukončení programu zkumavky vyndejte a 10 μl směsi naneste na 2% agarózový gel. Po separaci detekujte pod ÚV zářením, vizualizujte a vyhodnoťte.

Doporučení: Je vhodné amplifikovaný úsek dále zpracovat ihned po PCR reakci, nebo zamrazit a skladovat při -20° C, použijte vždy čerstvý elektroseparační pufr a minimalizujte dobu detekce UV zářením. Jinak dochází k degradaci vzorků.

• Restrikční analýza

1. Izolujte DNA plasmidy z bakteriálních kolonií, resp. kultury, po inkubaci přes noc (viz kapitola Transformace). K získání vzorků pomocí snadné minipreparační metody lze použít GeneJET Plasmid Miniprep Kit, který je schopen zajistit dostatečné množství a vysokou kvalitu preparátů během 5 minut.
2. Vštěpení cizorodé DNA z rekombinantních klonů (opět během 5 minut) je možné provést například prostřednictvím Thermo Scientific FastDigest restrikčních enzymů.
3. Fragmenty z restrikce separujte v agarózovém gelu a vyhodnoťte jako v kapitole analýza metodou PCR.

• Sekvenování

1. Izolujte DNA plasmidy z bakteriálních kolonií, resp. kultury, po inkubaci přes noc (viz kapitola Transformace). K získání vzorků lze použít GeneJET Plasmid Miniprep Kit, který je schopen zajistit dostatečné množství a vysokou kvalitu preparátů jen během 5 minut.
2. Sekvenaci klonů proveďte nejlépe přímo standadními M13/pUC sekvenčními primery nebo pomocí T7 promotor sekvenčního primeru (součástí kitu).
3. Připravte dostatečné množství reakční směsi (master mixu) pro sekvenování dle rozpisu níže, a to pro každý vzorek (tj. 20 μl tohoto roztoku na 1 vzorek):

Dále postupujte jako při analýze metodou PCR.