Upravit stránku

Konstrukce NGS knihovny pomocí ClaSeek™ Library Preparation Kit pro sekvenování na systému Iont Torrent

Připravili jsme pro vás pracovní protokol pro konstrukce NGS knihovny pomocí Thermo Scientific ClaSeekLibrary Preparation Kit. Přečtěte si nejprve stručný popis kitu a seznamte se s principem uváděné technologie. Následují obecná doporučení, požadavky na vybavení vaší laboratoře a nakonec jednotlivé části protokolu:
  • Specifikace ClaSeek Library Preparation Kit

    Specifikace ClaSeek Library Preparation Kit

    Thermo Scientific ClaSeek Library Preparation Kit (kompatibilní se systémem Ion Torrent) je určen pro rychlou a pohodlnou konstrukci NGS knihovny bez amplifikace z výchozího množství DNA až 5ng. ClaSeek Library Preparation Kit využívá optimalizovaný protokol pro vysoce účinnou konstrukci NGS knihovny, přičemž kombinuje kroky - úpravu konců, přečištění a připojení adaptérů do jednoduché a rychlé metody.

    Připravené směsi enzymů v kitu minimalizují zbytečné pipetovací kroky a snižují tak čas manuálního zpracování, což umožňuje konstrukci PCR - free knihovny za pouhých 60 minut. Kit je vhodný pro konstrukci knihoven s délkou čtení 100, 200, 300 nebo 400 bazí na systému Ion PGM a 150 nebo 200 bazí na systému Ion Proton.

  • Princip technologie

    Princip technologie

    Thermo Scientific ClaSeek technologie využívá rychlou a efektivní metodu pro konstrukci NGS knihovny, která kombinuje úpravu konců DNA fragmentů a připojení adaptérů do jednoduchého a rychlého protokolu. Při prvním kroku jsou upraveny konce fragmentované DNA a následně se provede rychlé přečištění vzorků od enzymů pomocí kolonové chromatografie. V dalším kroku jsou Ion Torrent kompatibilní NGS adaptéry připojeny ke koncům DNA fragmentů.

    Thermo Scientific ClaSeek Library Preparation Kit může být použit spolu s MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit (externí odkaz) (nové okno), což umožňuje výběr čisté DNA knihovny připravené pro sekvenování v rámci požadované délky čtení.

    Alternativně kit lze použít společně s Thermo Scientific GeneJET NGS Cleanup Kit pro přečištění vzorku před výběrem velikosti na agarózovém gelu pomocí nástrojů E - Gel® iBase (Life Technologies, Inc) nebo Pippin Prep (Life Technologies, Inc). Další krok amplifikace je k dispozici pro DNA knihovny určené pro sekvenování na systému Ion Proton nebo pro multiplex sekvenování několika knihoven s čárovým kódem, které byly připraveny z malého množství výchozí DNA.

  • Požadavky na výchozí DNA a obecná doporučení

    Požadavky na výchozí DNA a obecná doporučení

    • Protokol je optimalizovaný pro konstrukci PCR free knihovny při použití 5ng - 1ug kvalitní fragmentované genomové DNA, která může být rozpuštěná ve vodě bez nukleáz, 10 mM Tris, pH 7,5-8,5 nebo TE pufru (10 mM Tris -Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA).
    • Vzorky DNA musí být bez kontaminujících proteinů, RNA, organických rozpouštědel a solí. U vzorků DNA s neznámou kvalitou doporučujeme přečištění. Nejlepší kvalita DNA je dosažena při purifikaci vzorků pomocí komerčních kitů, jako je Thermo Scientific GeneJET NGS Cleanup Kit.
    • Dodržujte pravidla správné laboratorní praxe s cílem minimalizovat křížovou kontaminaci produktů. Používejte špičky s filtry, a pokud je to možné, provádějte konstrukci knihovny v odděleném prostoru nebo místnosti.
    • Provádějte všechny kroky při MagJET výběru velikosti v 1,5 ml Eppendorf LoBind zkumavkách (Eppendorf).
    • Rozmrazujte roztoky před použitím na ledě a udržujte je na něm, dokud nejsou připraveny k použití. Promíchejte roztoky důkladně na vortexu před každým použitím.
    • Minimalizujte čas skladování roztoků ClaSeek End Conversion Master Mix a ClaSeek Ligation Mix mimo mrazák neboli mimo -20 °C.

Další požadované reagencie a vybavení, které nejsou součástí kitu

  • Vybavení pro enzymatickou nebo fyzikální fragmentaci DNA
  • 0,2 ml a 0,5 ml tenkostěnné PCR zkumavky nebo destičky
  • Zkumavky LoBind 1,5 ml (Eppendorf)
  • Pipety a špičky
  • Mikrocentrifuga
  • Termocykler
  • Vortex
  • Real Time termocykler
  • Agilent® 2100 Bioanalyzer® nebo jiná srovnatelná metoda pro ověření kvality DNA knihovny
  • Ion Library Quantification Kit (Life Technologies, Inc.) nebo jiný srovnatelný kit pro kvantifikaci neamplifikované knihovny

A dále použijte dle potřeby:

  • Thermo Scientific MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit pro výběr velikosti.
  • Thermo Scientific GeneJET NGS Cleanup Kit pro přečištění fragmentované DNA.
  • Thermo Scientific Phusion Hot Start II High - Fidelity DNA Polymerase pro amplifikaci knihovny prep.
  • Nástroje E-Gel® iBase (Life Technologies, Inc.) nebo Pippin Prep (Life Technologies, Inc.) pro výběr velikosti fragmentů knihovny z agarózového gelu.
ClaSeek Library Preparation Kit
ClaSeek Library Preparation Kit

PROTOKOL

A. Úprava konců a připojení adapterů

Úprava konců fragmentované DNA

1. Pipetujte všechny reagencie v daném pořadí do 0,5 ml zkumavky. Udržujte směs na ledě.

SložkaObjem
Voda (bez nukleáz)do 50 μL
Fragmentovaná DNA (5ng-1μg)  X μL
ClaSeek End Conversion Master Mix25 μL
Celkem50 μL

2. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.

3. Inkubujte v termocykleru po dobu 5 minut při teplotě 20 °C. Vraťte zkumavku na led a okamžitě pokračujte v kroku přečištění po úpravě konců.

Přečištění po úpravě konců

  1. Převeďte reakční směs z předešlého kroku na kolonku. Centrifugujte po dobu 2 minut při 14 000 x g  při pokojové teplotě.
  2. Pečlivě shromážděte celý vzorek a přepipetujte 45ul protečeného vzorku do nové 0,2 ml tenkostěnné zkumavky. Vraťte zkumavku na led a okamžitě pokračujte krokem připojení adaptérů.

Připojení sekvenačních adaptérů

1. Napipetujte všechny reagencie v uvedeném pořadí do přečištěné reakční směsi (45ul). Udržujte směs na ledu. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.

Složka Objem
Column-filtrated End Conversion reaction mix45 μL
Adaptéry*20 μL
ClaSeek Ligation Mix35 μL
Celkem100 μL
2. Inkubujte směs v termocykleru (s vyhřívaným víkem na 60°C) po dobu 5 minut při teplotě 20 °C5 minut při teplotě 60 °C a na závěr udržujte směs při teplotě 4 °C. Okamžitě pokračujte krokem výběr velikosti a přečištění nebo vzorek uskladněte při teplotě -20 °C.

B. Přečištění NGS knihovny a výběr velikost

I. Výběr velikosti pomocí magnetických kuliček (Hlavní protokol)

Výběr velikosti u prep knihoven připravených pomocí Thermo Scientific ClaSeek Library Preparation Kit může být proveden pomocí MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit, který umožňuje výběr čisté DNA knihovny přímo připravené pro sekvenování v požadovaném intervalu délky čtení. Tento protokol je k dispozici na stránkách společnosti Thermo Scientific. Protokol zajišťuje odstranění adaptérů, a proto, po výběru velikosti, může být DNA přímo použita pro sekvenování bez dalšího čištění.

II. Alternativní protokol pro výběr velikosti na agarózovém gelu

  • Následující protokol vyžaduje krok přečištění pomocí Thermo Scientific GeneJET NGS Cleanup Kit před výběrem velikosti na agarózovém gelu s použitím E - Gel® iBase (Life Technologies, Inc.) nebo Pippin Prep (Life Technologies, Inc.), nebo jiného srovnatelného systému.
  • Protokol pro přečištění (A) pomocí Thermo Scientific GeneJET NGS Cleanup Kit je k dispozici na stránkách společnosti Thermo Scientific.

C. Stanovení kvality DNA knihovny

  • Doporučujeme ověřit distribuci velikosti fragmentů pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer a High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.). Před analýzou vzorky nařeďte. Knihovny (po MagJET výběru velikosti) vytvořené z velkého množství výchozí DNA (1ug) se ředí 10x . DNA knihovny připravené z malého množství DNA (≤ 100 ng) lze analyzovat neředěné. I když je finální koncentrace knihovny vytvořené z malého množství DNA (5-10ng) mimo kvantitativní rozsah přístroje, doporučujeme provést analýzu, abyste se ujistili, že vzorky nejsou kontaminovány adaptéry. Vzorky, u nichž byl proveden výběr velikost z agarózového gelu, by měly být analyzovány neředěné.
  • Kvantifikujte knihovnu pomocí Ion Library Quantification Kit (Life Technologies, Inc.) a stanovte diluční faktor templátu (TDF). 20 000násobné ředění se doporučuje pro knihovny získané z 25ng - 1ug výchozí DNA (po MagJET výběru velikosti) a z 1ug výchozí DNA (po výběru velikosti z agarózového gelu). 2 000násobné ředění se doporučuje pro knihovny připravené z < 25 ng DNA (po MagJET výběru velikosti) a z 100 ng DNA po výběru velikosti z agarózového gelu.
  • Obecně, 5 ng - 1ug a 100ng - 1ug knihovny po MagJET výběru nepotřebují amplifikaci pro sekvenování na Ion PGM a Ion Proton. Přejděte k amplifikaci, pokud je výtěžek neamplifikované knihovny nedostačující pro experimentální požadavky (Protokol D).

D. Alternativní protokol pro amplifikaci DNA knihovny

PCR amplifikace DNA s připojenými adaptéry (adaptér-ligovaná DNA)

1. Přidejte 20 ul adaptér-ligované DNA knihovny (získané po výběru velikosti) z protokolu B do prázdné tenkostěnné 0,2 ml zkumavky. Přidejte následující reagencie v daném pořadí. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.

Složka Objem
Adapter-ligovaná DNA20 μL
Voda (bez nukleáz)47 μL
5x Phusion HF Buffer20 μL
dNTP 10 mM2 μL
Library Amplification Primer mix10 μL
Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase 2U/μL1 μL
Celkem100 μL

Následující Thermo Scientific produkty je nutné zakoupit samostatně:

2. Rozdělte reakční směs do 2 tenkostěnných 0,2 ml zkumavek (u některých PCR přístrojů se nedoporučuje amplifikace DNA v reakčním objemu vyšším než 50ul).

3. Proveďte PCR s použitím následujících podmínek (teplota víka 105 °C):

Teplota Čas Cykly / množství DNA
98 °C30 sec 
98 °C20 sec4 cykly/ 100 ng-1 μg DNA
8 cyklů/ < 100 ng DNA
60 °C20 sec 
72 °C40 sec 
72 °C60 sec 
4 °Chold 

Přečištění amplifikované knihovny

Proveďte purifikaci amplifikované DNA knihovny pomocí MagJET NGS Size Selection a Cleanup Kit (externí odkaz) (nové okno)podle Protokolu přečištění dostupného na stránkách Thermo Scientific (externí odkaz) (nové okno). Proveďte eluci DNA knihovny do 30ul elučního pufru. Případně použijte Thermo Scientific GeneJET™ NGS Cleanup Kit podle Protokolu přečištění ((externí odkaz) (nové okno)) dostupného na stránkách Thermo Scientific (externí odkaz) (nové okno). Proveďte eluci DNA knihovny do 30ul elučního pufru.

Ověření kvality a kvantity amplifikované knihovny

Stanovte kvalitu připravené DNA knihovny analýzou na Agilent 2100 Bioanalyzer® a proveďte kvantifikaci knihovny pomocí qPCR.

Obrázek 1. Relativní distribuce velikostí fragmentované genomové DNA z E. coli. 
Distribuce velikosti fragmentů byla analyzována na přístroji Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc); pro analýzu bylo použito 5ng fragmentované gDNA.

Obrázek 1

Obrázek 2. Relativní distribuce velikostí fragmentů genomové DNA knihovny (E. coli) vytvořené pomocí Thermo Scientific ClaSeek Library Preparation Kit. 
100ng a 1ug fragmentované DNA (viz Obr. 1) byly použity pro přípravu knihoven. Protokol MagJET byl použit pro výběr velikosti DNA fragmentů se střední velikostí knihovny 330 bp. Distribuce velikosti fragmentů byla analyzována na Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)

A. Fragmenty DNA (neředěný vzorek) po výběru velikosti  - 100ng knihovny.

B. Fragmenty DNA (10-krát zředěný vzorek) po výběru velikosti - 1ug knihovny.

Obrázek 2
Nahoru