Připravili jsme pro vás pracovní protokol pro konstrukce NGS knihovny pomocí Thermo Scientific ClaSeek™Library Preparation Kit. Přečtěte si nejprve stručný popis kitu a seznamte se s principem uváděné technologie. Následují obecná doporučení, požadavky na vybavení vaší laboratoře a nakonec jednotlivé části protokolu:
-
Specifikace ClaSeek Library Preparation Kit
Specifikace ClaSeek Library Preparation Kit
Thermo Scientific ClaSeek Library Preparation Kit (kompatibilní se systémem Ion Torrent™) je určen pro rychlou a pohodlnou konstrukci NGS knihovny bez amplifikace z výchozího množství DNA až 5ng. ClaSeek Library Preparation Kit využívá optimalizovaný protokol pro vysoce účinnou konstrukci NGS knihovny, přičemž kombinuje kroky - úpravu konců, přečištění a připojení adaptérů do jednoduché a rychlé metody.
Připravené směsi enzymů v kitu minimalizují zbytečné pipetovací kroky a snižují tak čas manuálního zpracování, což umožňuje konstrukci PCR - free knihovny za pouhých 60 minut. Kit je vhodný pro konstrukci knihoven s délkou čtení 100, 200, 300 nebo 400 bazí na systému Ion PGM™ a 150 nebo 200 bazí na systému Ion Proton™.
-
Princip technologie
Princip technologie
Thermo Scientific ClaSeek™ technologie využívá rychlou a efektivní metodu pro konstrukci NGS knihovny, která kombinuje úpravu konců DNA fragmentů a připojení adaptérů do jednoduchého a rychlého protokolu. Při prvním kroku jsou upraveny konce fragmentované DNA a následně se provede rychlé přečištění vzorků od enzymů pomocí kolonové chromatografie. V dalším kroku jsou Ion Torrent kompatibilní NGS adaptéry připojeny ke koncům DNA fragmentů.
Thermo Scientific ClaSeek Library Preparation Kit může být použit spolu s MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit
, což umožňuje výběr čisté DNA knihovny připravené pro sekvenování v rámci požadované délky čtení.Alternativně kit lze použít společně s Thermo Scientific GeneJET NGS Cleanup Kit pro přečištění vzorku před výběrem velikosti na agarózovém gelu pomocí nástrojů E - Gel® iBase™ (Life Technologies, Inc) nebo Pippin Prep™ (Life Technologies, Inc). Další krok amplifikace je k dispozici pro DNA knihovny určené pro sekvenování na systému Ion Proton™ nebo pro multiplex sekvenování několika knihoven s čárovým kódem, které byly připraveny z malého množství výchozí DNA.
-
Požadavky na výchozí DNA a obecná doporučení
Požadavky na výchozí DNA a obecná doporučení
- Protokol je optimalizovaný pro konstrukci PCR free knihovny při použití 5ng - 1ug kvalitní fragmentované genomové DNA, která může být rozpuštěná ve vodě bez nukleáz, 10 mM Tris, pH 7,5-8,5 nebo TE pufru (10 mM Tris -Cl, pH 8,0, 1 mM EDTA).
- Vzorky DNA musí být bez kontaminujících proteinů, RNA, organických rozpouštědel a solí. U vzorků DNA s neznámou kvalitou doporučujeme přečištění. Nejlepší kvalita DNA je dosažena při purifikaci vzorků pomocí komerčních kitů, jako je Thermo Scientific GeneJET™ NGS Cleanup Kit.
- Dodržujte pravidla správné laboratorní praxe s cílem minimalizovat křížovou kontaminaci produktů. Používejte špičky s filtry, a pokud je to možné, provádějte konstrukci knihovny v odděleném prostoru nebo místnosti.
- Provádějte všechny kroky při MagJET výběru velikosti v 1,5 ml Eppendorf™ LoBind™ zkumavkách (Eppendorf).
- Rozmrazujte roztoky před použitím na ledě a udržujte je na něm, dokud nejsou připraveny k použití. Promíchejte roztoky důkladně na vortexu před každým použitím.
- Minimalizujte čas skladování roztoků ClaSeek End Conversion Master Mix a ClaSeek Ligation Mix mimo mrazák neboli mimo -20 °C.
Další požadované reagencie a vybavení, které nejsou součástí kitu
- Vybavení pro enzymatickou nebo fyzikální fragmentaci DNA
- 0,2 ml a 0,5 ml tenkostěnné PCR zkumavky nebo destičky
- Zkumavky LoBind™ 1,5 ml (Eppendorf)
- Pipety a špičky
- Mikrocentrifuga
- Termocykler
- Vortex
- Real Time termocykler
- Agilent® 2100 Bioanalyzer® nebo jiná srovnatelná metoda pro ověření kvality DNA knihovny
- Ion Library Quantification Kit (Life Technologies, Inc.) nebo jiný srovnatelný kit pro kvantifikaci neamplifikované knihovny
A dále použijte dle potřeby:
- Thermo Scientific™ MagJET™ NGS Cleanup a Size Selection Kit pro výběr velikosti.
- Thermo Scientific™ GeneJET™ NGS Cleanup Kit pro přečištění fragmentované DNA.
- Thermo Scientific™ Phusion™ Hot Start II High - Fidelity DNA Polymerase pro amplifikaci knihovny prep.
- Nástroje E-Gel® iBase™ (Life Technologies, Inc.) nebo Pippin Prep™ (Life Technologies, Inc.) pro výběr velikosti fragmentů knihovny z agarózového gelu.
Příprava knihoven s čárovým kódem - důležité!
Pro multiplexování několika DNA knihoven v jednom běhu byste měli nahradit ClaSeek adaptéry (dodávané v kitu) Ion Xpress adaptéry s čárovými kódy: 10 ul Ion Xpress™ P1 adaptér a 10 ul zvoleného Ion Xpress™ čárového kódu X (1 adaptér s čárový kódem pro 1 knihovnu).
PROTOKOL
A. Úprava konců a připojení adapterů
Poznámka: Tento protokol obsahuje návod pro konstrukci knihovny bez amplifikace s použitím 5ng-1ug vysoce kvalitní fragmentované DNA, která je dostačující pro sekvenování na Ion PGM™. Další Amplifikační protokol (Protokol D) je k dispozici pro přípravu knihovny a sekvenování na Ion Proton™ při použití nízkého množství výchozí DNA (<100 ng) nebo pro multiplexování knihoven s čárovým kódem, které byly připraveny z nízkého množství výchozí DNA
Úprava konců fragmentované DNA
1. Pipetujte všechny reagencie v daném pořadí do 0,5 ml zkumavky. Udržujte směs na ledě.
| Složka | Objem |
| Voda (bez nukleáz) | do 50 μL |
| Fragmentovaná DNA (5ng-1μg) | X μL |
| ClaSeek End Conversion Master Mix | 25 μL |
| Celkem | 50 μL |
2. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.
3. Inkubujte v termocykleru po dobu 5 minut při teplotě 20 °C. Vraťte zkumavku na led a okamžitě pokračujte v kroku přečištění po úpravě konců.
Přečištění po úpravě konců
- Převeďte reakční směs z předešlého kroku na kolonku. Centrifugujte po dobu 2 minut při 14 000 x g při pokojové teplotě.
- Pečlivě shromážděte celý vzorek a přepipetujte 45ul protečeného vzorku do nové 0,2 ml tenkostěnné zkumavky. Vraťte zkumavku na led a okamžitě pokračujte krokem připojení adaptérů.
Poznámka: Reakční směs pipetujte přímo na střed membrány, abyste se nedotýkali stěn kolonky. Protečený objem použitý v následném kroku (připojení adapterů) by neměl být menší než 40ul. Zvyšování chybějícího objemu není potřeba.
Připojení sekvenačních adaptérů
1. Napipetujte všechny reagencie v uvedeném pořadí do přečištěné reakční směsi (45ul). Udržujte směs na ledu. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.
| Složka | Objem |
| Column-filtrated End Conversion reaction mix | 45 μL |
| Adaptéry* | 20 μL |
| ClaSeek Ligation Mix | 35 μL |
| Celkem | 100 μL |
Důležitá poznámka: Pro multiplexování několika DNA knihoven v jednom běhu byste měli nahradit ClaSeek adaptéry (dodávané v kitu) Ion Xpress adaptéry s čárovými kódy: 10 ul Ion Xpress™ P1 adaptér a 10 ul zvoleného Ion Xpress™ čárového kódu X (1 adaptér s čárový kódem pro 1 knihovnu). Ion Xpress™ P1 a adaptéry s čárovými kódy nejsou součástí kitu a je nutné zakoupit je samostatně (Life Technologies, Inc.).
2. Inkubujte směs v termocykleru (s vyhřívaným víkem na 60°C) po dobu 5 minut při teplotě 20 °C, 5 minut při teplotě 60 °C a na závěr udržujte směs při teplotě 4 °C. Okamžitě pokračujte krokem výběr velikosti a přečištění nebo vzorek uskladněte při teplotě -20 °C.
B. Přečištění NGS knihovny a výběr velikost
I. Výběr velikosti pomocí magnetických kuliček (Hlavní protokol)
Výběr velikosti u prep knihoven připravených pomocí Thermo Scientific ClaSeek™ Library Preparation Kit může být proveden pomocí MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit, který umožňuje výběr čisté DNA knihovny přímo připravené pro sekvenování v požadovaném intervalu délky čtení. Tento protokol je k dispozici na stránkách společnosti Thermo Scientific. Protokol zajišťuje odstranění adaptérů, a proto, po výběru velikosti, může být DNA přímo použita pro sekvenování bez dalšího čištění.
Důležitá upozornění:
- Abyste našli požadovaný objem vazebného roztoku (Binding Mix), vždy proveďte MagJET kalibrační protokol před výběrem velikosti vaší DNA knihovny. Důrazně doporučujeme používat fragmentovanou DNA a Agilent 2100 Bioanalyzer pro kalibrační protokol.
- Ujistěte se, že isopropanol byl správně smíchán s Binding Buffer před použitím. Postupujte podle pokynů pro přípravu Binding Mix.
- Ujistěte se, že používáte dobře kalibrované pipety.
- V protokolu může být použit pouze čerstvě připravený Binding Mix. Použití staršího roztoku (více než 24 hodin) vede k narušení vazebných podmínek a tvorbě sraženin.
- Zkontrolujte objem ligační reakční směsi obsahující DNA knihovnu (z protokolu A) před provedením MagJET výběr velikosti. Přidejte vodu nebo TE pufr do 100ul, pokud je objem DNA vzorku menší než 100ul.
- Provádějte všechny kroky protokolu MagJET výběr velikosti v 1,5 ml Eppendorf™ LoBind™zkumavkách.
- Chcete-li zajistit nejvyšší výnosy DNA, snažte se neztratit žádné magnetické kuličky v průběhu čištění a nezkracujte inkubační dobu.
- Proveďte eluci DNA do 30ul elučního pufru. Uskladněte knihovnu o vybrané velikosti při teplotě -20 °C. Odeberte 3ul knihovny (určené pro sekvenování) pro stanovení distribuce velikosti fragmentů na přístroji Agilent 2100 Bioanalyzer a pro kvantifikaci DNA knihovny pomocí qPCR.
II. Alternativní protokol pro výběr velikosti na agarózovém gelu
- Následující protokol vyžaduje krok přečištění pomocí Thermo Scientific™ GeneJET™ NGS Cleanup Kit před výběrem velikosti na agarózovém gelu s použitím E - Gel® iBase™ (Life Technologies, Inc.) nebo Pippin Prep™ (Life Technologies, Inc.), nebo jiného srovnatelného systému.
- Protokol pro přečištění (A) pomocí Thermo Scientific™ GeneJET™ NGS Cleanup Kit je k dispozici na stránkách společnosti Thermo Scientific.
Důležitá upozornění:
-
Důležitá upozornění:
- Před prvním použitím přidejte uvedené množství etanolu (96-100 %) do Pre - Wash Buffer (koncentrovaný) a Wash Buffer (koncentrovaný).
- Před každým použitím zkontrolujte, zda všechny roztoky v kitu nevykazují vysrážení solí. Sraženiny lze rozpustit zahřátím roztoků na 37 °C a pak je vytemperujte na pokojovou teplotu (15-25 °C).
- Proveďte eluci DNA knihovny do 20ul elučního pufru. Purifikovaná DNA může být uložena při teplotě -20 °C.
- Pokračujte výběrem velikosti na agarózovém gelu s použitím E - Gel® iBase™ (Life Technologies, Inc.) nebo Pippin Prep™ (Life Technologies, Inc.). Návod pro výběr velikosti lze nalézt na stránkách společnosti Life Technologies a Sage Science. Vyberte adaptér ligovanou DNA ve správném rozmezí velikosti (bp): 200 bp, 330 bp, 390 bp a 480 bp pro 100, 200, 300 nebo 400 bazí čtení pro použití na Ion PGM™ a 220 bp, 270 bp pro 150 nebo 200 bazí čtení pro použití na Ion Proton™ systému.
C. Stanovení kvality DNA knihovny
- Doporučujeme ověřit distribuci velikosti fragmentů pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer a High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.). Před analýzou vzorky nařeďte. Knihovny (po MagJET výběru velikosti) vytvořené z velkého množství výchozí DNA (1ug) se ředí 10x . DNA knihovny připravené z malého množství DNA (≤ 100 ng) lze analyzovat neředěné. I když je finální koncentrace knihovny vytvořené z malého množství DNA (5-10ng) mimo kvantitativní rozsah přístroje, doporučujeme provést analýzu, abyste se ujistili, že vzorky nejsou kontaminovány adaptéry. Vzorky, u nichž byl proveden výběr velikost z agarózového gelu, by měly být analyzovány neředěné.
- Kvantifikujte knihovnu pomocí Ion Library Quantification Kit (Life Technologies, Inc.) a stanovte diluční faktor templátu (TDF). 20 000násobné ředění se doporučuje pro knihovny získané z 25ng - 1ug výchozí DNA (po MagJET výběru velikosti) a z 1ug výchozí DNA (po výběru velikosti z agarózového gelu). 2 000násobné ředění se doporučuje pro knihovny připravené z < 25 ng DNA (po MagJET výběru velikosti) a z 100 ng DNA po výběru velikosti z agarózového gelu.
- Obecně, 5 ng - 1ug a 100ng - 1ug knihovny po MagJET výběru nepotřebují amplifikaci pro sekvenování na Ion PGM™ a Ion Proton™. Přejděte k amplifikaci, pokud je výtěžek neamplifikované knihovny nedostačující pro experimentální požadavky (Protokol D).
D. Alternativní protokol pro amplifikaci DNA knihovny
Poznámka: Tento protokol obsahuje návod pro amplifikaci (zmnožení) knihoven vytvořených z 5 ng-1 ug výchozí DNA.
PCR amplifikace DNA s připojenými adaptéry (adaptér-ligovaná DNA)
1. Přidejte 20 ul adaptér-ligované DNA knihovny (získané po výběru velikosti) z protokolu B do prázdné tenkostěnné 0,2 ml zkumavky. Přidejte následující reagencie v daném pořadí. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.
| Složka | Objem |
| Adapter-ligovaná DNA | 20 μL |
| Voda (bez nukleáz) | 47 μL |
| 5x Phusion HF Buffer | 20 μL |
| dNTP 10 mM | 2 μL |
| Library Amplification Primer mix | 10 μL |
| Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase 2U/μL | 1 μL |
| Celkem | 100 μL |
Následující Thermo Scientific produkty je nutné zakoupit samostatně:
- Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase, 2U/μL
- dNTP Mix, 10 mM každý
2. Rozdělte reakční směs do 2 tenkostěnných 0,2 ml zkumavek (u některých PCR přístrojů se nedoporučuje amplifikace DNA v reakčním objemu vyšším než 50ul).
3. Proveďte PCR s použitím následujících podmínek (teplota víka 105 °C):
| Teplota | Čas | Cykly / množství DNA |
| 98 °C | 30 sec | |
| 98 °C | 20 sec | 4 cykly/ 100 ng-1 μg DNA 8 cyklů/ < 100 ng DNA |
| 60 °C | 20 sec | |
| 72 °C | 40 sec | |
| 72 °C | 60 sec | |
| 4 °C | hold |
Přečištění amplifikované knihovny
Proveďte purifikaci amplifikované DNA knihovny pomocí MagJET NGS Size Selection a Cleanup Kit podle Protokolu přečištění dostupného na stránkách Thermo Scientific . Proveďte eluci DNA knihovny do 30ul elučního pufru. Případně použijte Thermo Scientific™ GeneJET™ NGS Cleanup Kit podle Protokolu přečištění (A ) dostupného na stránkách Thermo Scientific . Proveďte eluci DNA knihovny do 30ul elučního pufru.
Ověření kvality a kvantity amplifikované knihovny
Stanovte kvalitu připravené DNA knihovny analýzou na Agilent™ 2100 Bioanalyzer® a proveďte kvantifikaci knihovny pomocí qPCR.
Obrázek 1. Relativní distribuce velikostí fragmentované genomové DNA z E. coli.
Distribuce velikosti fragmentů byla analyzována na přístroji Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc); pro analýzu bylo použito 5ng fragmentované gDNA.
Obrázek 2. Relativní distribuce velikostí fragmentů genomové DNA knihovny (E. coli) vytvořené pomocí Thermo Scientific™ ClaSeek™ Library Preparation Kit.
100ng a 1ug fragmentované DNA (viz Obr. 1) byly použity pro přípravu knihoven. Protokol MagJET byl použit pro výběr velikosti DNA fragmentů se střední velikostí knihovny 330 bp. Distribuce velikosti fragmentů byla analyzována na Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
A. Fragmenty DNA (neředěný vzorek) po výběru velikosti - 100ng knihovny.
B. Fragmenty DNA (10-krát zředěný vzorek) po výběru velikosti - 1ug knihovny.
