Připravili jsme pro vás pracovní protokol a podrobný návod na použití Thermo Scientific ClaSeek™ Library Preparation Kit.
Hledaný výraz musí mít více jak 2 znaky.
Připravili jsme pro vás pracovní protokol a podrobný návod na použití Thermo Scientific ClaSeek™ Library Preparation Kit.
Thermo Scientific ClaSeek Library Preparation Kit (kompatibilní se systémem Ion Torrent™) je určen pro rychlou a pohodlnou konstrukci NGS knihovny bez amplifikace z výchozího množství DNA až 5ng. ClaSeek Library Preparation Kit využívá optimalizovaný protokol pro vysoce účinnou konstrukci NGS knihovny, přičemž kombinuje kroky - úpravu konců, přečištění a připojení adaptérů do jednoduché a rychlé metody.
Připravené směsi enzymů v kitu minimalizují zbytečné pipetovací kroky a snižují tak čas manuálního zpracování, což umožňuje konstrukci PCR - free knihovny za pouhých 60 minut. Kit je vhodný pro konstrukci knihoven s délkou čtení 100, 200, 300 nebo 400 bazí na systému Ion PGM™ a 150 nebo 200 bazí na systému Ion Proton™.
Thermo Scientific ClaSeek™ technologie využívá rychlou a efektivní metodu pro konstrukci NGS knihovny, která kombinuje úpravu konců DNA fragmentů a připojení adaptérů do jednoduchého a rychlého protokolu. Při prvním kroku jsou upraveny konce fragmentované DNA a následně se provede rychlé přečištění vzorků od enzymů pomocí kolonové chromatografie. V dalším kroku jsou Ion Torrent kompatibilní NGS adaptéry připojeny ke koncům DNA fragmentů.
Thermo Scientific ClaSeek Library Preparation Kit může být použit spolu s MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit
, což umožňuje výběr čisté DNA knihovny připravené pro sekvenování v rámci požadované délky čtení.
Alternativně kit lze použít společně s Thermo Scientific GeneJET NGS Cleanup Kit pro přečištění vzorku před výběrem velikosti na agarózovém gelu pomocí nástrojů E - Gel® iBase™ (Life Technologies, Inc) nebo Pippin Prep™ (Life Technologies, Inc). Další krok amplifikace je k dispozici pro DNA knihovny určené pro sekvenování na systému Ion Proton™ nebo pro multiplex sekvenování několika knihoven s čárovým kódem, které byly připraveny z malého množství výchozí DNA.
Pro multiplexování několika DNA knihoven v jednom běhu byste měli nahradit ClaSeek adaptéry (dodávané v kitu) Ion Xpress adaptéry s čárovými kódy: 10 ul Ion Xpress™ P1 adaptér a 10 ul zvoleného Ion Xpress™ čárového kódu X (1 adaptér s čárový kódem pro 1 knihovnu).
1. Pipetujte všechny reagencie v daném pořadí do 0,5 ml zkumavky. Udržujte směs na ledě.
Složka | Objem |
Voda (bez nukleáz) | do 50 μL |
Fragmentovaná DNA (5ng-1μg) | X μL |
ClaSeek End Conversion Master Mix | 25 μL |
Celkem | 50 μL |
2. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.
3. Inkubujte v termocykleru po dobu 5 minut při teplotě 20 °C. Vraťte zkumavku na led a okamžitě pokračujte v kroku přečištění po úpravě konců.
1. Napipetujte všechny reagencie v uvedeném pořadí do přečištěné reakční směsi (45ul). Udržujte směs na ledu. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.
Složka | Objem |
Column-filtrated End Conversion reaction mix | 45 μL |
Adaptéry* | 20 μL |
ClaSeek Ligation Mix | 35 μL |
Celkem | 100 μL |
Výběr velikosti u prep knihoven připravených pomocí Thermo Scientific ClaSeek™ Library Preparation Kit může být proveden pomocí MagJET NGS Cleanup a Size Selection Kit, který umožňuje výběr čisté DNA knihovny přímo připravené pro sekvenování v požadovaném intervalu délky čtení. Tento protokol je k dispozici na stránkách společnosti Thermo Scientific. Protokol zajišťuje odstranění adaptérů, a proto, po výběru velikosti, může být DNA přímo použita pro sekvenování bez dalšího čištění.
Důležitá upozornění:
1. Přidejte 20 ul adaptér-ligované DNA knihovny (získané po výběru velikosti) z protokolu B do prázdné tenkostěnné 0,2 ml zkumavky. Přidejte následující reagencie v daném pořadí. Reakční směs promíchejte vortexováním (3-5 sekund) a krátce centrifugujte.
Složka | Objem |
Adapter-ligovaná DNA | 20 μL |
Voda (bez nukleáz) | 47 μL |
5x Phusion HF Buffer | 20 μL |
dNTP 10 mM | 2 μL |
Library Amplification Primer mix | 10 μL |
Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase 2U/μL | 1 μL |
Celkem | 100 μL |
Následující Thermo Scientific produkty je nutné zakoupit samostatně:
2. Rozdělte reakční směs do 2 tenkostěnných 0,2 ml zkumavek (u některých PCR přístrojů se nedoporučuje amplifikace DNA v reakčním objemu vyšším než 50ul).
3. Proveďte PCR s použitím následujících podmínek (teplota víka 105 °C):
Teplota | Čas | Cykly / množství DNA |
98 °C | 30 sec | |
98 °C | 20 sec | 4 cykly/ 100 ng-1 μg DNA 8 cyklů/ < 100 ng DNA |
60 °C | 20 sec | |
72 °C | 40 sec | |
72 °C | 60 sec | |
4 °C | hold |
Proveďte purifikaci amplifikované DNA knihovny pomocí MagJET NGS Size Selection a Cleanup Kit
podle Protokolu přečištění dostupného na stránkách Thermo Scientific
. Proveďte eluci DNA knihovny do 30ul elučního pufru. Případně použijte Thermo Scientific™ GeneJET™ NGS Cleanup Kit podle Protokolu přečištění (A
) dostupného na stránkách Thermo Scientific
. Proveďte eluci DNA knihovny do 30ul elučního pufru.
Stanovte kvalitu připravené DNA knihovny analýzou na Agilent™ 2100 Bioanalyzer® a proveďte kvantifikaci knihovny pomocí qPCR.
Obrázek 1. Relativní distribuce velikostí fragmentované genomové DNA z E. coli.
Distribuce velikosti fragmentů byla analyzována na přístroji Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc); pro analýzu bylo použito 5ng fragmentované gDNA.
Obrázek 2. Relativní distribuce velikostí fragmentů genomové DNA knihovny (E. coli) vytvořené pomocí Thermo Scientific™ ClaSeek™ Library Preparation Kit.
100ng a 1ug fragmentované DNA (viz Obr. 1) byly použity pro přípravu knihoven. Protokol MagJET byl použit pro výběr velikosti DNA fragmentů se střední velikostí knihovny 330 bp. Distribuce velikosti fragmentů byla analyzována na Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
A. Fragmenty DNA (neředěný vzorek) po výběru velikosti - 100ng knihovny.
B. Fragmenty DNA (10-krát zředěný vzorek) po výběru velikosti - 1ug knihovny.