Pracovní protokol na použití setu Rapid DNA Ligation Kit. Zjistíte, jak postupovat při spojování cizorodých DNA.
Hledaný výraz musí mít více jak 2 znaky.
Pracovní protokol na použití setu Rapid DNA Ligation Kit. Zjistíte, jak postupovat při spojování cizorodých DNA.
Zpracovali jsme pro vás podrobný návod - pracovní protokol na použití setu Rapid DNA Ligation Kit. Tento systém se používá pro přímé spojování cizorodých DNA za vzniku rekombinantního vektoru. Pomocí kitu je možné snadno vložit restriktázou ošetřený DNA produkt do linearizovaného vektoru, který byl rozštěpen stejným způsobem (tedy totožnou restriktázou). Kit zahrnuje ligázu (T4 DNA Ligase) a speciálně optimalizovaný pufr (5X Rapid Ligation Buffer) pro skutečně rychlou a kvalitní ligaci těchto dvou molekul různého původu.
Rapid DNA Ligation Kit | varianta 50 reakcí | varianta 150 reakcí |
ligáza (T4 DNA Ligase) 5U/μl | 50 μl | 150 μl |
pufr (5X Rapid Ligation Buffer) | 1 ml | 2x0.75 ml |
voda (Water, nuclease-free) | 1.25 ml | 2x1.25 ml |
Systém obsahuje vektor, do kterého je vložen vyšetřovaný fragment, respektive PCR produkt po štěpení, a oba jsou následně spojeny při tzv. ligaci. Tuto ligační reakci řídí enzym T4 DNA ligáza, která katalyzuje tvorbu fosfodiesterové vazby mezi vzájemně cizími úseky DNA. Ligace pomocí kitu Rapid DNA Ligation Kit umožňuje sjednotit štěpené PCR produkty, a to jak s přesahujícími tak tupými konci a po té přejít plynule k následujícímu kroku klonování – transformaci, kdy je rekombinantní vektor přímo namnožen.
Už i tak velmi dobré vlastnosti (rychlost, kvalita a výtěžek) se mohou dále zvýšit kombinací použitých komerčních sad, jako například při použití kitu TransformAid™ Bacterial Transformation Kit k přípravě kompetentních buněk. Aplikací tohoto systému je příprava odpovídajících bakteriálních kolonií nesrovnatelně rychlejší a doba od amplifikace původní sekvence v místě s variabilitou (eventuálně s mutací nebo jinou numerickou či nukleotidovou aberací) až po transformaci je podstatně kratší.
Rapid DNA Ligation Kit je schopen spojit PCR produkt s linearizovaným vektorem, přičemž tyto DNA se mohou libovolně kombinovat bez ohledu na jejich původ. Po ligaci je rekombinantní vektor začleněn do libovolného hostitelského organismu. V případě DNA analýz dle postupu sady TransformAid™ Bacterial Transformation Kit jde o transformaci do buněk E.Coli. Nejčastěji bývají transformovány běžné laboratorní kmeny této bakterie.
Systém Rapid DNA Ligation Kit poskytuje při reakci vysokou účinnost spojování (vytváření fosfodiesterových vazeb) a taktéž jistý komfort při samotné analýze. Laboratorní práce je totiž díky těmto produktům velmi usnadněna a příjemná rovněž jejich komplexita, což znamená, že jednotlivé komerční sady na sebe navazují bez nutnosti nákupu dalších speciálních chemikálií.
Reakční směs je navržena tak, aby vzorek po PCR reakci mohl být přímo ligací vložen do linearizovaného vektoru a transformován do bakteriální buňky E. Coli, a to jak klasickou metodou, jako například elektroporace, tak pomocí návazného TransformAid Bacterial Transformation Kit.
Správná funkce toho kitu byla potvrzena experimentálně, konkrétně při klonování 2000bp dlouhého PCR produktu o délce 2000 bp a hmotnosti 130 ng, který byl zakončen tupými konci a současně 50 ng PCR produktu kontrolní pUC19 DNA (součástí kitu). DNA byly štěpeny enzymem SmaI a vzniklé tupé konce spojeny ligací s využitím systému Rapid DNA Ligation Kit a deforforylovány alkalickou fosfatázou. Výtěžek, respektive množství bílých kolonií po transformaci do kompetentních E.coli XL1-Blue buněk, činil >1x105 cfu/μg DNA s účinností transformace 1x107 buněk na 1μg DNA.
1. Do předem popsané 0,2 μl zkumavky připravit na ledu následující reakční směs o celkovém objemu 20 μl:
Takto připravenou směs krátce vortexovat a centrifugovat 3 – 5 s.
2. Reakční směs inkubovat 5 minut při laboratorní teplotě (cca. 22°C).
3. Použít 2-5 μl této inkubované směsi přímo pro transformování kompetentních buněk.
Linearizovaný vektor má tendenci spojit se opět v jeden celek (recirkulizovat) a tím by se ligace stala obtížnější. Uzavření plasmidu lze bránit defosforylací, např. enzymem FastAP Alkaline Phosphatase nebo Shrimp Alkaline Phosphatase.
Recirkulizace probíhá v objemu 50 μl této reakční směsi (předpis pro jeden vzorek):
1. Do předem popsané mikrozkumavky připravit následující reakční směs (celkový objem 50 μl):
Takto připravenou směs krátce vortexovat a „stočit“ na mikrocentrifuze (cca. 3 – 5 s).
2. Reakční směs inkubovat 5 minut při laboratorní teplotě (cca. 22°C).
3. Použít 2-5 μl této inkubované směsi přímo pro transformování kompetentních buněk.
Vektor s analyzovaným fragmentem je přenesen přes buněčnou a cytoplasmatickou membránu do vnitřního prostředí bakteriální buňky (transformace) a zde se množí (klonuje). Úspěšnost transformace je různá a liší se dle použité techniky. Nejúčinnější je elektroporace (109 cfu/μg DNA), avšak tato metoda je vhodná především pro rozsáhlé úseky o délce > 3 kb. Nejrychleji je naopak rekombinantní vektor přenesen pomocí komerčně dostupných kitů. Na předešlou ligaci sadou Rapid DNA Ligation Kit snadno navazuje např. TransformAid Bacterial Transformation Kit, který je doporučován nejen pro snadnost, ale především pro rychlost transformací.
Účinnost ligace, tedy množství spojených molekul DNA z celkového množství v reakční směsi, je stanovena (odečtena, určena) na základě pruhů na agarózovém gelu. Tyto tzv. bandy jsou odečítány po separaci produktů a koncentrace, resp. množství, bývá v praxi většinou odhadnuto ze srovnání se standardem, například GeneRuler DNA Ladder Mix.
Při nanášení vzorků je nutné k oddělenému alikvotu přidat SDS-supplemented loading dye, což je SDS sonda eliminující posun bandů (např. 6X DNA Loading Dye & SDS Solution), které je způsobeno nejčastěji navázáním T4 DNA ligázy na ligační produkt.
Pozn.: Praktické je nanést na gel produkty vzorků různých fází transformace v tomto pořadí:
Slábnoucí tendence bandů (tzv. profil vzorků), odpovídá klesající molekulové hmotnosti. Tento profil indikuje úspěšně provedenou ligaci. Profil bez viditelných změn poukazuje na problémy během ligace.
Pozn.: Nejsilnější bandy charakterizují vzorky o nejvyšší koncentraci DNA, nejslabší naopak nejmenší množství DNA a t z nich, které při elektroseparaci postupují nejpomaleji mají nejvyšší molekulovou hmotnost (závislost na rychlosti putování je nepřímá).