Molekulární (DNA) klonování je metoda, která umožňuje tvorbu klonů DNA neboli velkého počtu molekul DNA identických s původní klonovanou molekulou. Tato metoda se využívá například pro studium struktury a funkce genů, tvorbu chimerických genů nebo produkci rekombinantních proteinů.
Proces molekulárního klonování
Zdroj: www.labguide.cz
Jak probíhá molekulární klonování?
- Princip metody je založen na vložení klonované DNA do molekulárního nosiče (klonovací vektor), který je vnesen do hostitelské buňky.
- V hostitelské buňce je využit její replikační aparát, a dojde tak k namnožení vektoru.
- Buňky jsou následně kultivovány (pomnoženy).
- Na závěr se provede selekce klonů obsahujících klonovanou DNA.
Postup molekulárního klonování
1. Příprava rekombinantní DNA
Prvním krokem klonování je příprava rekombinantní DNA, která vzniká vložením klonovaného úseku DNA (inzertu) do vektoru in vitro. Vektor je molekulární systém, který obsahuje všechny sekvence potřebné pro vložení inzertu, jeho replikaci v hostitelské buňce a následnou selekci klonů obsahujících vektor s inzertem.
Struktura klonovacího vektoru
Zdroj: www.labguide.cz
- Jako vektory se používají nejčastěji plazmidy, bakteriofágy a umělé chromosomy.
- Plazmidy jsou kruhové molekuly DNA, do kterých lze vkládat inzerty o délce až 15 kb.
- Vektory obsahující regulační oblasti potřebné pro expresi proteinu z vložené DNA se označují jako expresní vektory.
- Kosmidy jsou plazmidy upravené pro klonování velkých fragmentů DNA (45kb) a obsahují tzv. cos sekvence z bakteriofága lambda.
- Cos sekvence jsou dlouhé cca 200bp, ohraničují inzert a v nich dochází ke štěpení vedoucí k linearizaci cirkulárního kosmidu.
- Bakteriofágy jsou viry infikující bakterie a lze do nich klonovat inzerty DNA dlouhé 40 - 50kb.
- Umělé bakteriální nebo kvasinkové chromosomy umožňují replikaci celého chromosomu a lze do nich klonovat inzerty DNA větší než 47 kb.
2. Vložení inzertu do vektoru
Pro vložení inzertu do vektoru se používají různé klonovací metody, které se liší úpravou konců inzertu a vektoru.
- Při klasickém klonování je vektor štěpen v klonovacím místě restrikční endonukleázou za vzniku tupých nebo kohezivních konců v závislosti na koncích vkládaného inzertu (konce musí být kompatibilní). Tyto konce jsou následně spojeny pomocí enzymu T4 DNA ligázy.
- Pro klonování PCR fragmentů se hojně používá TA klonování. Tato metoda využívá faktu, že standardní Taq polymerázy nemají 3′ - 5′ exonukleázovou aktivitu a na 3′ konci PCR produktu zařazují adenin. Amplifikované fragmenty potom mají na 3’ konci převis jednoho adeninu a jsou spojeny s vektorem, který má na 5’ koncích převis jednoho tyminu. Při PCR klonování je inzert amplifikován pomocí primerů, které již obsahují restrikční místa a ta jsou využita pro štěpení a ligaci.
3. Transformace
Po vytvoření rekombinantní DNA (vektor s inzertem) je tento konstrukt vnesen do hostitelských buněk prostřednictvím transformace, konjugace nebo transdukce.
- Nejčastěji se používá transformace do bakteriálních kompetentních buněk, které mají schopnost přirozeně přijmout cizorodou DNA.
- Využívají se především bakterie Escherichia coli, které se velmi rychle množí.
- Aby došlo ke vstupu vektoru do buňky, musí se zajistit prostupnost cytoplazmatické membrány bakterií, a to buď mírným teplotním šokem (42 °C), nebo elektroporací, při které dojde ke vzniku pórů.
- Po transformaci jsou bakteriální buňky naneseny na pevné kultivační médium v Petriho misce.
- Buňky se inkubují přes noc při 37 °C a na médiu tvoří kolonie. Jedna kolonie vyroste vždy z jedné původní buňky, takže každá kolonie představuje jeden klon identických buněk.
4. Kultivace
Během kultivace dochází také ke dvojité selekci pozitivních klonů. Kultivační médium jednak obsahuje antibiotikum, vůči kterému budou rezistentní pouze buňky s vektorem, neboť vektor nese gen pro rezistenci. Na misce tedy vyrostou pouze buňky obsahující vektor.
Cílem druhé selekce je odlišit klony buněk obsahující vektor bez inzertu od klonů nesoucích vektor s inzertem. Nejčastěji se používá tzv. modro-bílá selekce, kdy klonovací místo vektoru obsahuje gen LacZ kódující enzym β-galaktosidázu. Tento enzym přeměňuje bezbarvou galaktozu X-Gal (obsaženou v médiu) na 5-bromo-4-chloro-indoxyl, který spontánně oxiduje a tvoří modré barvivo. Pokud se tedy inzert vloží do klonovacího místa, je gen rozštěpen a daná buňka nebude metabolizovat X-Gal. Tato buňka bude tvořit bílé kolonie, zatímco buňky, u kterých nedošlo k integraci inzertu do vektoru, budou mít gen LacZ neporušený a bude se tvořit modré zbarvení. Pro kontrolu, zda klony nesou inzert, lze použít i PCR nebo restrikční štěpení.
5. Ověření
Na závěr metody se provádí ověření, zda vybrané klony skutečně obsahují náš specifický klonovaný inzert. Toto ověření lze provést pomocí PCR, restrikčním štěpením nebo sekvenováním. Výsledkem molekulárního klonování je tedy obrovské množství kopií původní klonované molekuly DNA.