Upravit stránku

DNBseqTM Small RNA Sequencing

Popis služby

Malé RNA jsou nekódujících molekuly RNA (ncRNA), které jsou kratší než 200 nt. Často se podílejí na umlčování genů a na post-transkripční regulaci genové exprese. Sekvenování malých RNA se používá k objevování nových malých RNA, zkoumání rozdílné exprese všech malých RNA a k charakterizaci variant s rozlišením na úrovni jedné báze.

Jedinečné molekulární identifikátory (UMI) lze použít k eliminaci nežádoucích PCR duplikátů získaných z jedné molekuly. Po PCR se předpokládá, že molekuly sdílející UMI pocházejí ze stejné vstupní molekuly. Počet UMI jako takový nabízí vynikající výsledky při počítání čtení, což vede k přesnějším odhadům kvantity exprese malých RNA [1].

Technologie UMI je zvláště výhodná pro zákazníky, kteří provádějí výzkum vzácných vzorků nebo vzorků obsahujících méně RNA, jako jsou exosomy. Naše služba DNBseqTM pro sekvenování malých RNA s volitelnou technologií UMI poskytuje přesná, přehledná a vysoce kvalitní sekvenační data pro podporu Vašich akademických a klinických výzkumných aplikací.

 

Specifikace sekvenační služby

Služba DNBseqTM Small RNA Sequencing se provádí s DNBseq sekvenační technologií, obsahující cPAS a DNA Nanoballs (DNB) pro vynikající kvalitu dat.

• 50bp single-end sekvenačních čtení

• Standardní výstup 20 milionů čistých čtení na vzorek

• Dostupná technologie UMI pro zvýšenou přesnost kvantifikace

• Čistá data a pokročilá bioinformatická analýza jsou k dispozici u standardních formátů souborů

• Standardní a zakázková bioinformatická analýza dat

• Dostupné aplikace pro ukládání dat a bioinformatiky

Čas odezvy

• Většinou 25 pracovních dnů od přijetí QC vzorku až po filtrovaná hrubá data

• K dispozici jsou i rychlé služby, kontaktujte místního BGI specialistu pro podrobnosti

 

Postup projektu

Staráme se o Vaše vzorky od začátku až po dodání výsledků. Velmi zkušení laboratorní odborníci dodržují přísnou kvalitu postupů k zajištění integrity Vašich výsledků.

DNBseqTM Sekvenační technologie

DNBseq je inovativní vysokokapacitní technologie pro sekvenování vyvinutá BGI dceřinou společností Complete Genomics v Silicon Valley. DNBseq technologie využívá kombinatorní technologii Probe-Anchor Synthesis (cPAS) a vylepšené DNA Nanoballs (DNB). Chemie cPAS funguje začleněním fluorescenční sondy do DNA kotvy na DNB, následuje digitální zobrazení s vysokým rozlišením.

Kombinace lineární amplifikace a technologie DNB snižuje chybovost a zvyšuje signál, což má skutečné výhody. Kromě toho je velikost DNB kontrolována tak, že pouze jedna DNB je vázána na jedno aktivní místo. Tato array technologie poskytuje nejen přesnost sekvenování, ale také zvyšuje využití čipu a hustotu vzorku.

 

 

 

Analýza dat

Kromě čistých dat nabízí BGI řadu standardních a zakázkových bioinformatických postupů pro Vaše projekty zaměřené na sekvenování malých RNA.

Zprávy a výstupní datové soubory jsou dodávány v standardních FASTQ a Excel formátech s tabulkami a obrázky připravenými k publikování.

 

Standardní bioinformatické analýzy

• Filtrování dat

• Distribuce délky malých RNA

• Analýza společných a specifických sekvencí mezi dvěma vzorky

• Distribuce malých RNA mezi vybranými genomy

• Identifikace rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA atd.

• Identifikace malých RNA asociovaných s repeticemi

• Identifikace sekvencí malých RNA, které by mohly být přiřazeny k exon / intron

• Identifikace známých miRNA, které jsou součástí miRBase

• Analýza expresního profilu známých miRNA

• Klasifikace malých RNA do několika kategorií podle preference zákazníka

• Predikce nových miRNA a jejich sekundárních struktury podle Mireap a miRDeep z neanotovaných malých RNA

• Analýza rodin známých miRNA

 

Zakázkové analýzy

Další přizpůsobení bioinformatických analýz podle Vašeho jedinečného projektu je dostupné:

Obraťte se na svého technického zástupce BGI.

 

 

Požadavky na vzorky

Můžeme zpracovat Vaše vzorky z člověka, rostlin, živočichů a mikrobů s následujícími obecnými požadavky:

 

 

 

Stabilní a vysoce kvalitní datový výkon

Technická reprodukovatelnost

Pro demonstraci vysoké technické reprodukovatelnosti DNBseq platformy bylo na DNBseq sekvenováno šest vzorků lidského mozku, dva vzorky srdce a dva vzorky krve. Reprodukovatelnost byla hodnocena pomocí šesti technických replikátů vzorku lidského mozku (viz obr. 1). Střední korelace mezi šesti replikáty byla 0,98 a kvantil 25% a 75% byl 0,98 a 0,99.

 

Obr. 1 Korelační matice vzorků mozku (šest technických replikátů), srdce (dva technické replikáty) a krve (dva biologické replikáty) sekvenované systémem DNBseq.

 

Distribuce exprese miRNA na DNBseq, HiSeq platformách a mikročipech [3]

Porovnání distribuce sekvenačních čtení ve vzorcích lidské krve na HiSeq s těmi na systému DNBseq ukázalo rovnoměrnější pokrytí méně zastoupených druhů miRNA v systému DNBseq, což usnadňuje objev nových miRNA. Diagram na obrázku níže ukazuje, že 90,8% všech sekvenačních čtení v krvi na HiSeq se shoduje s jednou jedinou miRNA. 98,6% ze všech čtení z HiSeq se shoduje s top 10 miRNA. Pro DNBseq se 93,1% všech sekvenačních čtení shoduje s top 10 miRNA. Zbývajících 6,9% čtení odpovídá zbytku miRNA. U Agilent mikročipů se předpokládá, že součet všech intenzit exprese je 100%, protože mikročipy vykazují saturační efekt. Jedna z prvních deseti miRNA, miR-451a, která se nachází v 0,8% HiSeq čtení a v 45,9% DNBseq čtení, má nejvyšší expresi na mikročipech s 37,2% všech expresních počtů.

 

Obr. 2. Distribuce exprese 10 miRNA s nejvyšší detekcí v krevní RNA na (a) HiSeq, (b) DNBseq a (c) mikročipech.

 

Vynikající shoda v detekci známých miRNA  mezi HiSeq a DNBseq

Shoda v detekci známých miRNA v lidském vzorku mezi dvěma platformami je nad 80%, jak ukazují níže uvedená data (interní data).

 

Obr. 3. Vennův diagram známých lidských miRNA detekovaných na platformách HiSeq a DNBseq.

 

 

Identifikované známé miRNA na platformě DNBseq

Známé miRNA z různých druhů byly identifikovány na platformách DNBseq i HiSeq v interním experimentu, přičemž na DNBseq byl detekován trvale vyšší počet známých miRNA ve srovnání s platformou HiSeq. Tato data naznačují vyšší citlivost detekce miRNA na DNBseq.

Obr. 4. Porovnání identifikovaných známých miRNA mezi platformou DNBseq a HiSeq.

Reference

 

1) Fu Y, Wu PH, Beane T, Zamore PD, Weng Z: Elimination of PCR duplicates in RNA-seq and small RNA-seq using unique molecular identifiers. BMC Genomics 2018;19:531.

2) Drmanac R, Sparks AB, Callow MJ, Halpern AL, Burns NL, Kermani BG, Carnevali P, Nazarenko I, Nilsen GB, Yeung G, Dahl F, Fernandez A, Staker B, Pant KP, Baccash J, Borcherding AP, Brownley A, Cedeno R, Chen L, Chernikoff D, Cheung A, Chirita R, Curson B, Ebert JC, Hacker CR, Hartlage R, Hauser B, Huang S, Jiang Y, Karpinchyk V, Koenig M, Kong C, Landers T, Le C, Liu J, McBride CE, Morenzoni M, Morey RE, Mutch K, Perazich H, Perry K, Peters BA, Peterson J, Pethiyagoda CL, Pothuraju K, Richter C, Rosenbaum AM, Roy S, Shafto J, Sharanhovich U, Shannon KW, Sheppy CG, Sun M, Thakuria JV, Tran A, Vu D, Zaranek AW, Wu X, Drmanac S, Oliphant AR, Banyai WC, Martin B, Ballinger DG, Church GM, Reid CA: Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays. Science 2010;327:78-81.

3) Fehlmann T, Reinheimer S, Geng C, Su X, Drmanac S, Alexeev A, Zhang C, Backes C, Ludwig N, Hart M, An D, Zhu Z, Xu C, Chen A, Ni M, Liu J, Li Y, Poulter M, Li Y, Stahler C, Drmanac R, Xu X, Meese E, Keller A: cPAS-based sequencing on the BGISEQ-500 to explore small non-coding RNAs. Clin Epigenetics 2016;8:123.

Nahoru