Proč společnost BGI vybrala ORF1ab jako cílovou sekvenci pro detekci 2019-nCoV?

Po analýze sekvence celého genomu nového koronavirusu, Národní čínská zdravotní komise doporučila tři specifické oblasti (ORF1ab, E, N) viru pro návrh PCR primerů. Když je vyvíjen kit pro detekci 2019-nCov, primer může být navržen na základě kterékoli z těchto tří oblastí a není nutné testovat všechny tři oblasti současně.

Samotný gen N je relativně konzervovaný u koronavirů a dochází ke zkřížené reaktivitě s jinými koronaviry, zejména s koronaviry, jako je 229E, OC43 a HKU-1, které existují v přirozeném oběhu a infikují člověka, ale mají špatnou přenositelnost, což vede k nesprávné diagnóze. Aby se předešlo zkřížené reaktivitě s jinými patogeny, je důležité najít specifické oblasti 2019-nCoV pomocí bioinformatických analýz. BGI identifikovala specifické oblasti v genomu 2019-nCoV, hlavně se zaměřením na geny ORF1ab a S, a vyvinula detekční systém pro 2019-nCoV s robustním a nejlepším výkonem screeningu a vyhodnocení. Současně BGI vyrobila detekční systém specifický pro detekci N genu a praktický test ukázal, že mezi koronaviry skutečně existuje zkřížená reaktivita. To znamená, že když by byl N gen vybrán jako cílová sekvence pro detekci 2019-nCoV, další koronaviry by byly také falešně pozitivní.

Proto BGI vybrala ORF1ab jako cílovou sekvenci pro detekci nového koronavirusu a 26. ledna 2020 získala regulační certifikaci od National Medical Products Administration (NMPA) a 2. března 2020 značku CE IVD.

Proč BGI testuje pouze jeden gen?

Specifičnost a účinnost primer-sonda systému udává výkon qPCR kitu, který je také hlavním faktorem pro efekt kvality různých výrobců. Výběr vhodné cílové oblasti vyžaduje dobrou referenční sekvenci a bohaté biologické informace. BGI byla jednou z prvních institucí, které detekovaly 2019-nCoV ve Wu-chanu. Poprvé získala celý genom virusu, což poskytlo efektivní způsob, jak vyvinout citlivý a specifický RT-PCR kit. Mezitím bohaté bioinformatické schopnosti BGI umožňují získat cílovou oblast vhodnou pro návrh primerů a sondy.

Dalším faktorem, který určuje kvalitu produktu - stabilní procesní systém. Díky mnohaletým zkušenostem ve vývoji in vitro diagnostických reagencií, společnost BGI vytvořila vysoce účinný a stabilní procesní systém. Právě díky výhodám výše uvedených aspektů má detekční kit od BGI dobrý analytický výkon, který prošel přezkoumáním State Food and Drug Administration a získal osvědčení o registraci zdravotnických prostředků.

Geny, které mohou účinně identifikovat 2019-nCoV, jsou hlavně genové oblasti orf1ab a S, takže není nutné detekovat dva geny současně. Například obvykle testujeme jeden specifický gen na HIV a HBV. Navíc N gen je ve skutečnosti konzervovaný gen a nemůže účinně identifikovat 2019-nCoV, protože bude zkříženě reagovat s jinými koronaviry.

Více genů není nutně lepší pro detekci patogenů. Primery a sondy budou ve skutečnosti navzájem interferovat, což povede ke snížení citlivosti, ve kterém bude duplexní PCR slabší než jednoplexní PCR a triplexní PCR bude nižší než duplexní. V současné době jsou metody detekce více patogenních nukleových kyselin pohodlné a snadno použitelné, ale kvůli vzájemné interferenci je citlivost multiplexní PCR výrazně nižší než citlivost jediné detekce. Například citlivost multiplexní PCR detekující EV (enterický virus) je pouze asi 80% v porovnání s PCR detekující jediný marker.

Podle posledních klinických výsledků Čína identifikovala gen orf1ab jako specifický diagnostický cílový gen pro 2019-nCoV. Ve všech výrobcích schválených NMPA se orf1ab používá jako cíl pro konečné stanovení 2019-nCoV, N a E se používají jako doplňující geny. Je také zřejmé, že jiné koronavirové infekce nejsou vyloučeny, pokud je E nebo N použit jako cílový gen pro detekci. V praxi je potřeba zohlednit konzervativnost při navrhování primerů pro N gen, což také ovlivňuje citlivost klinické diagnózy. V některých případech byl úspěšně amplifikován pouze gen orf1ab a gen N selhal, což také ovlivnilo správnou interpretaci výsledků.

Porovnání různých metod

1. Velké množství detekční kapacity musí být poskytnuto co nejdříve po propuknutí epidemie, v tomto směru je výhodný komerční kit pro jednokrokovou reakci.

2. Kit BGI RT-PCR byl testován na více než 1 milionu vzorků. Vykazuje dobrý klinický výkon a byl validován velkým počtem vzorků.