Základním rozdílem mezi Sangerovým sekvenováním a sekvenováním příští generace (NGS) je objem sekvenování. Pojďme se ale na rozdíly mezi těmito metodami podívat detailněji.
Hledaný výraz musí mít více jak 2 znaky.
Srovnání Sangerova sekvenování a sekvenování nové generace NGS
Základním rozdílem mezi Sangerovým sekvenováním a sekvenováním příští generace (NGS) je objem sekvenování.
- Sangerova metoda sekvenuje pouze jeden fragment DNA v čase a zaměřuje se pouze na konkrétní gen (nebo několik genů) nebo variantu.
- NGS, sekvenace nové generace, je masivně paralelní a sekvenuje miliony fragmentů současně v rámci jednoho běhu. Tento proces umožňuje sekvenování stovek až tisíců genů najednou. NGS také nabízí větší možnost objevovat nové nebo vzácné varianty pomocí hlubokého sekvenování.
Výhody
Sangerovo sekvenování
- Rychlé a finančně efektivní sekvenování pro nízký počet cílů (1–20 cílů)
- Dlouhá čtení, snadné sestavování čteních (zejména u GC bohaté vysoce repetitivní DNA)
- Jednodušší pracovní postup
- Snadná analýza dat
- Malé uložiště dat
NGS sekvenování nové generace
- Vyšší hloubka sekvenování umožňuje vyšší citlivost (až 1 %)
- Vyšší schopnost objevovat nové varianty
- Větší rozlišení mutací (od velkých chromozomálních přestaveb až po jednonukleotidové varianty)
- Více dat generovaných ze stejného množství vstupní DNA
- Škálovatelné na celý genom
- Vysokokapacitní a multiplexní
- Nízká cena za 1 bázi
Nevýhody
Sangerovo sekvenování
- Nízká citlivost (limit detekce ~15–20%)
- Nelze detekovat chromozomální aberace, varianty v počtu kopií
- Nízká schopnost objevovat nové varianty
- Není finančně a časově efektivní pro vysoký počet cílů (> 20 cílů)
- Vysoká cena za 1 bázi
- Nízká škálovatelnost díky vyšším požadavkům na vstupní množství vzorku
NGS sekvenování nové generace
- Méně finančně a časově efektivní pro sekvenování nízkého počtů cílů (1–20 cílů)
- Krátká čtení, problémy se sestavováním čtení
- Velké úložiště dat
- Složitá analýza dat
Aplikace NGS
(Slabý O. Technologie sekvenování nové generace: celogenomové, celoexomové a cílené – hotspot – sekvenování. www.prolekare.cz)
Celogenomové sekvenování (WGS)
stanovení kompletní sekvence genomové DNA
Výhody
- Poskytuje sekvence kódujících i nekódujících oblastí genomu
- Představuje nejkomplexnější způsob charakterizace genomové DNA
- Velký význam z hlediska translačního onkologického výzkumu
- Umožňuje výpočet mutační nálože (TMB)
Nevýhody
- Velké množství získaných dat klade vysoké nároky na jejich interpretaci, a to především v případě náhodných potenciálně rizikových nálezů
- Finanční a časová náročnost
Celoexomové sekvenování (WES)
stanovení sekvence přibližně 1% genomové DNA představující kódující oblasti
Výhody
- Většina patogenních variant (85%) leží v kódujících částech genomu
- Funkční dopady těchto variant jsou lépe interpretačně uchopitelné
- Oproti WGS umožňuje větší hloubku čtení
- Umožňuje výpočet mutační nálože (TMB)
Nevýhody
- Neumožňuje identifikaci variant v nekódujících oblastech genomu
- Problém s náhodnými potenciálně rizikovými nálezy
Cílené (hotspot) sekvenování (sekvenační panely)
stanovení sekvence vybraných genů, případně vybraných genomových oblastí
Výhody
- Méně finančně a časově náročné
- Cílení na konkrétní geny a varianty (hotspoty) umožňuje jejich snadnou klinickou interpretaci
- Malé riziko náhodných nálezů
- Vysoká senzitivita
- Metodika umožňuje snadnější optimalizaci a standardizaci ve srovnání s WGS a WES
- Umožňuje výpočet mutační nálože TMB (při počtu genů na panelu > 200)
Nevýhody
- Největší limitací je nízká šíře pokrytí, determinovaná počtem sekvenovaných genů, která může vést k nezachycení potenciálně klinicky významné varianty (s rostoucím počtem genů pokrytých panelem tato limitace úměrně ztrácí na významu)
Spolupracujeme s německou značkou Atlas Biolabs a s firmou GENEWIZ a jejich prostřednictvím vám můžeme poskytnout profesionální NGS služby.