31. srpna 2021
Adeno-asociovaný virus (AAV) je mocným nástrojem pro genovou terapii, avšak práce s AAV vektory může být náročná. Každý konstrukt obsahuje dvě invertované terminální repetice (ITR) o délce obvykle 145 bp, které ohraničují gen zájmu. ITR tvoří vysoce stabilní T-tvarované vlásenky, které jsou klíčové pro replikaci a zapouzdření virové DNA. Tyto strukturální změny však mohou také způsobit problémy v tradičních klonovacích pracovních postupech. Spontánní delece v oblasti ITR komplikují přípravu DNA přenosového plazmidu a tvorba sekundární struktury ztěžuje potvrzovací sekvenování. Výzkumníci tak čelí dvojitému problému: nejenže jsou AAV vektory náchylné k truncacím ITR, ale také je obtížné tyto mutace detekovat. Zde se budeme zabývat výzvami při propagaci a validaci AAV plazmidů a návrhem optimalizovaného přístupu k pracovnímu postupu.
Výroba rekombinantních částic AAV. Zájmový gen se klonuje do vektoru AAV, čímž se vytvoří přenosový plazmid, který se poté zavede do eukaryotické buněčné linie. Generování funkčních virových částic vyžaduje ko-transfekci s několika virovými geny, které dodávají obalovací plazmidy (tj. Rep/Cap a pomocné plazmidy). Rekombinantní jednořetězcová DNA obsahující transgen lemovaný sekvencemi invertovaných terminálních repetic (ITR) je zabalena do kapsid. ITR tvoří velmi stabilní vlásenky, které jsou problematické pro amplifikaci a sekvenování AAV plazmidů v raných fázích pracovního postupu.s.
Pracovní postup pro produkci rekombinantních AAV částic
Produkce rekombinantních AAV částic. Určený nebo vybraný gen je klonován do AAV vektoru k vytvoření přenosového plazmidu, který je následně zaveden do eukaryotické buněčné linie. Generování funkčních virových částic vyžaduje kotransfekci s několika virovými geny, které jsou dodávány balicími plazmidy (tj. Rep/Cap a pomocnými plazmidy). Rekombinantní jednovláknová DNA obsahující transgen ohraničený invertovanými terminálními repetice (ITR) je zapouzdřena do kapsidů. ITR tvoří velmi stabilní vlásenky, které jsou problematické pro amplifikaci a sekvenování AAV plazmidů během počátečných kroků pracovního postupu.
Nestabilita ITR
Oblasti ITR v AAV plazmidech jsou notoricky nestabilní. Jejich palindromická povaha a vysoký obsah GC je činí náchylnými k úplným nebo částečným delecím během propagace v bakteriích. Výsledkem je, že významná část klonů po transformaci může obsahovat mutované ITR a přípravy plazmidové DNA z tekuté kultury mohou obsahovat jejich smíšenou populaci. Podkladový mechanismus tohoto jevu v bakteriích není dobře pochopen; sekundární struktura a skluz vlákna v replikační vidlici mohou hrát svou roli. Ztráta ITR sekvencí poskytuje hostitelským bakteriím růstovou výhodu, takže mutace se může rychle amplifikovat v rostoucí kultuře. I při nejlepších standardních postupech mohou přípravy AAV plazmidů obsahovat významnou frakci (5-15 %) plazmidové DNA s mutovanými ITR sekvencemi. Přerušení ITR může vést ke snížené účinnosti virového balení a zvýšené variabilitě v následných experimentech.
Nestabilita sekvencí ITR v plazmidech
Plazmidy se sekvencemi ITR vykazují vysokou nestabilitu. (A) Během množení v bakteriálních buňkách často vznikají v ITR mutace a zkrácení. (B) Při výběru kolonií z agarové plotny může mnoho klonů obsahovat mutaci. (C) Při pěstování bakterií v tekuté kultuře může výsledný plazmidový preparát obsahovat směs molekul DNA.
Výzvy při detekci mutací ITR
Vzhledem k frekvenci trunkací, které se vyskytují v AAV plazmidech, je klíčové sledovat integritu ITR během klonování, zejména před virovým balením. Sangerovo sekvenování je zlatým standardem pro potvrzení sekvence plazmidu; avšak standardní protokoly nedokážou číst oblasti ITR. Silná sekundární struktura ITR inhibuje polymeraci DNA, což vede k významnému poklesu intenzity signálu v chromatogramech. Běžné strategie pro sekvenování obtížných templátů, jako je přidání DMSO a/nebo betainu, jsou pro ITR neúčinné.
Sekvenační chromatogram sekvence ITR ukazující časné ukončení sekvence
Sekvenační chromatogram ukazující předčasné ukončení signálu na začátku sekvence ITR. Standardní protokoly pro Sangerovo sekvenování nedokážou přečíst oblasti ITR. Tradičně se při screeningu delecí ITR provádějí restrikční digesce. Enzymy SmaI a SrfI se často používají, protože štěpí v rámci C-C' ramene ITR. Vzhledem k omezenému rozlišení gelové elektroforézy nedokážou diagnostické digesce nedokážou detekovat malé delece a bodové mutace ležící mimo restrikční místo. Stručně řečeno, analýza restrikčními enzymy sama o sobě není pro sledování integrity ITR v plazmidech dostatečná.
Restrikční enzymová analýza nedokáže odhalit malé delece v ITR. (A) Restrikční mapa plasmidu AAV, ve kterém SmaI dvakrát řeže oblast ITR. (B) Gel z trávení SmaI ukazující pásy očekávané velikosti. (C) Analyzovaný plazmidový preparát má ve skutečnosti deleci ramene B-B' v jedné z oblastí ITR, která byla zjištěna pomocí sekvenování AAV-ITR společnosti Azenta. Elektroforéza v agarózovém gelu nemá dostatečné rozlišení, aby bylo možné identifikovat ztrátu 22 bp.
Jak optimalizovat přípravu AAV plazmidů
Následující proaktivní opatření mohou minimalizovat riziko mutací v ITR minimalizovat a poskytnout efektivní kontrolu kvality příprav AAV plazmidů.
1. Použijte bakteriální kmen, který udržuje integritu ITR
Přiklonování AAV konstruktů se obvykle používají rekombinančně-deficientní kmen y(např. JC8111, SURE2, Stabl3, XL10-Gold), protože snižují pravděpodobnost delecí ITR.Nicméně, v závislosti na konkrétním konstruktu, může být velmi obtížné pomocí komernčních kmenů izolovat klon s plně neporušenými ITR pomocí komerčních kmenů, dokonce i těch, které postrádají RecA. Aby se tento nedostatek překonal, Azenta Life Sciences vyvinula proprietární bakteriální kmeny specificky optimalizované pro udržení integrity ITR během propagace plazmidu. Kmeny Azenta překonaly tři komerční kmeny při testování osmi AAV plazmidů s různými základy. Tento rozdíl byl výraznější u tří nejnáročnějších plazmidů, přičemž komerční kmeny nedokázaly generovat klon s plně neporušenými ITR alespoň pro dva z testovaných plazmidů.
S neoptimálními bakteriálními kmeny se příprava plazmidu stává zdlouhavější: je třeba screenovat více kolonií, pokud se vůbec podaří získat správný klon. Také během amplifikace je větší pravděpodobnost, že se objeví mutace, což vede ke smíšené populaci plazmidů, která může ovlivnit následné experimenty nebo vyžadovat novou izolaci klonu.(Přípravu AAV plazmidu pro sekevnování).
2. Použijte robustní, citlivý test k detekci mutací ITR
Jak bylo diskutováno výše, standardní sekvenační protokoly nejsou účinné při čtení ITR a restrikční digesce poskytují omezené informace o sekvencích ITR. Nedostatek adekvátních metod pro měření integrity ITR často zanechává výzkumníky nejisté ohledně kvality jejich příprav AAV plazmidů. V reakci na to Azenta Life Sciences vyvinula radikálně nový Sangerův sekvenační protokol ( Sangerova sekvenování virového plazmidu), který dokáže číst obtížné oblasti ITR, poskytující potvrzení integrity ITR na úrovni jednoho nukleotidu.
Oblast ITR analyzovaná pomocí standardního protokolu Sangerova sekvenování ve srovnání s metodou sekvenování AAV-ITR společnosti Azenta. Ta si zachovává silný signál přes sekvenci ITR a poskytuje užitečné čtení.
Některé zkrácené ITR jsou překvapivě obtížnější sekvenovat než neporušené, protože vedou k vlásenkovým strukturám s výrazně větší stabilitou. Alternativní sekvenační protokoly mohou mít určitý úspěch při čtení neporušených oblastí ITR, ale pravděpodobně selžou při sekvenování těchto obtížnějších trunkací. Následkem toho může přítomnost takové mutace ve smíšené populaci uniknout vaší pozornosti. Metoda sekvenování Azenta AAV-ITR je dostatečně robustní, aby dokázala číst jak divoké, tak mutantní ITR, což umožňuje detekci velmi náročných truncací ITR v klonálních a heterogenních populacích plazmidové DNA.
3. Provádějte kontroly QC pro integritu ITR brzy a často
Včasené zachycení mutací včas a přijetí okamžitých nápravných opatření může ušetřit značný čas a úsilí v budoucnu a vést k reprodukovatelnějším výsledkům v pozdějších experimentech. Robustnější pracovní postup přípravy AAV plazmidů zahrnuje více kontrol QC. Vzhledem k tomu, že truncace ITR mohou vzniknout v jakémkoli kroku zahrnujícím amplifikaci v bakteriích, je klíčové zajistit integritu ITR během celého klonovacího procesu. Je důležité analyzovat plazmidy pomocí sekvenování AAV-ITR po každé přípravě DNA, aby se potvrdilo, že ITR jsou neporušené a klonální. Pro přípravy vykazující smíšenou populaci by měl být znovu izolován klon se správnými sekvencemi ITR, nejlépe v bakteriálním kmeni, který je optimalizován pro AAV konstrukty.
Doporučené kontrolní body kontroly kvality (QC) pro integritu ITR. Oblasti ITR by měly být analyzovány sekvenováním AAV-ITR po každé přípravě plazmidové DNA, aby se zajistilo, že ITR jsou zcela neporušené a klonální.
Klíčové poznatky
- Invertované terminální repetice (ITR) sekvencích AAV vektorů jsou vysoce nestabilní, často akumulující delece během propagace plazmidu v bakteriích.
- Standardní metody pro potvrzení sekvence plazmidu nejsou dostatečné pro detekci trunkací ITR, které mohou negativně ovlivnit následné experimenty.
- Použití nejnovějších technologií pro přípravu a sekvenování AAV plazmidů může výrazně urychlit výzkum a zlepšit kvalitu rekombinantní AAV DNA.
Závěr
Strukturální vlastnosti ITR sekvencí představují významné problémy s kontrolou kvality pro výzkumníky, kteří se snaží vytvářet a klonovat AAV konstrukty. Nicméně, nedávné technologické pokroky řešily nejobtížnější výzvy, což umožňuje amplifikaci a potvrzení plně neporušených oblastí ITR.
Chcete-li se dozvědět více, přečtěte si naši technickou poznámku „Efektivní a vysoce věrný přístup k přípravě AAV plazmidů“.
Stáhnout technickou poznámku - pod článkem
Reference
1. Wilmott, P., Lisowski, L., Alexander, I. E. & Logan, G. J. A User’s Guide to the Inverted Terminal Repeats of Adeno-Associated Virus. Human Gene Therapy Methods 30, 206–213 (2019).
2. Oliveira, P. H., Prather, K. J., Prazeres, D. M. F. & Monteiro, G. A. Structural instability of plasmid biopharmaceuticals: challenges and implications. Trends in Biotechnology 27, 503–511 (2009).
3. Gray, J. T. & Zolotukhin, S. Design and Construction of Functional AAV Vectors. in Adeno-Associated Virus 25–46 (Humana Press, 2011).
4. Savy, A. et al. Impact of Inverted Terminal Repeat Integrity on rAAV8 Production Using the Baculovirus/Sf9 Cells System. Human Gene Therapy Methods 28, 277–289 (2017).
5. Kieleczawa J. Fundamentals of