Nukleotidy a priméry

Nukleové kyseliny jsou makromolekulární látky, jejichž základní stavební jednotkou je nukleotid. Nukleotid se skládá ze tří částí:

1. cukerné složky – pentózy (monosacharid s pěti uhlíky), DNA obsahuje 2–deoxy–D–ribózu, RNA obsahuje D–ribózu

2. dusíkaté báze – je navázána na cukernou složku, existují 4 typy (podle nich rozlišujeme 4 typy různých nukleotidů): adenin (A), guanin (G), cytosin (C), thymin (T) – obsažený pouze v DNA a uracil (U) – obsažený pouze v RNA

• adenin a guanin jsou báze purinové odvozené od purinu (heterocyklické sloučeniny se dvěma kondenzovanými heterocykly)
• cytosin, thymin a uracil jsou báze pyrimidinové odvozené od pyrimidinu (šestičlenné heterocyklické sloučeniny se dvěma heteroatomy)

Ribóza s dusíkatou bází tvoří nukleosid.

3. fosfátu – zbytek kyseliny ortofosforečné, který je navázán na 5' uhlíku každého nukleotidu, a jeho prostřednictvím jsou navázány jednotlivé nukleotidy a tvoří polynukleotidový řetězec.

Modifikované nukleotidy

Kromě přirozených/standardních nukleotidů jsou v metodách molekulární biologie široce využívány nukleotidy modifikované. Modifikaci mohou být podrobeny všechny tři části nukleotidu (cukerná část, fosfátová skupina i nukleobáze) v závislosti na potřebách dané aplikace - viz obrázek:

Nejběžnější modifikací nukleotidů je připojení fluorescenční značky (např. fluorescein) za účelem fluorescenčního značení DNA či RNA. Další významnou modifikací je zavedení chemicky reaktivní funkční skupiny (např. aminoalylová skupina) nebo reaktivních biomolekul (např. biotin) a jejich použití pro spojování s dalšími molekulami. Zavedení reaktivní aldehydové skupiny do DNA umožňuje např. barevně detekovat DNA díky typické reakci s arylhydraziny či kovalentně připojit peptid reduktivní aminací. Nejběžnějším systémem reaktivních molekul je biotin -streptavidin, což jsou proteiny vykazující vzájemně silnou afinitu. Tento systém se používá pro nepřímé značení DNA, kdy na biotinylované nukleotidy se váže streptavidin konjugovaný s fluorescenčním barvivem (např. Cy3 nebo Cy5).

Pro design primerů platí několik obecných pravidel, které je dobré dodržovat, abyste zajistili účinnou a specifickou amplifikaci:

• délka primerů by měla být 15 až 25 nukleotidů
• obsah GC se může pohybovat v rozmezí 20-70%, ale Tm primerů by se neměly výrazně lišit
• vyhněte se umístění více než dvou nukleotidů G nebo C v posledních pěti nukleotidech na 3'-konci, aby se snížilo riziko nespecifického nasednutí primerů.
• vyhněte se sekundárním strukturám v amplikonu.
• vyhněte se komplementaritě v rámci primeru, komplementaritě mezi primery a přímým repeticím v primeru, aby se zabránilo tvorbě vlásenek a dimerizaci primerů
• u primerů pro real-time PCR je optimální teplota tání (Tm) 60 °C, rozdíly v Tm obou primerů by neměly větší než 2 °C.

Obecné pokyny pro návrh dvojitě značených sond, jako jsou TaqMan sondy:

• obsah GC: 30-60%.
• délka: 20-30 nukleotidů
• Tm by měla být o 10°C vyšší než Tm primerů (obvykle 68 až 70°C)
• v blízkosti 5 'konce TaqMan sondy by se neměl vyskytovat G (může zhášet fluorescenci)
• sekvence by neměla obsahovat opakující se motivy stejné báze (může to mít vliv na účinnost hybridizace v důsledku tvorby sekundární struktury)
• vyberte templátové vlákno DNA, které obsahuje více C než G bazí
• vyhněte se sekundárním strukturám
• vyhněte se dimerizaci s primery
• modifikace nukleových kyselin jako LNA (Locked Nucleic Acids), PNA (Peptide Nucleic Acids) a MGB (Minor Groove Binders) mohou být použity pro optimalizaci Tm nebo délky sondy 

Webové aplikace pro navrhování primerů

BLAST	Vyhledává necílové sekvence shodné s potenciální sekvencí primerů.
Primer 3	Navrhuje sekvenci primerů.
RTPrimerDB	Databáze primerů nabízející již předdefinované a ověřené sekvence primerů.
NCBI	Používá Primer3 pro návrh primerů a poté je podrobí analýze BLAST.
Tm Calculator	Podle obsahu GC provádí výpočet teploty tání.