V úvodu si nejprve vysvětlíme základní princip PCR a následně se přesuneme k popisu konkrétní kvantitavní PCR reverzní transkripce. PCR neboli polymerázová řetězová reakce je metoda, která využívá aktivity nejrůznějších termostabilních polymeráz k množení vybraných úseků DNA. Výběr úseků se obvykle děje pomocí oligonukleotidů, jejichž sekvence jsou komplementární k jednomu z řetězců DNA a ohraničují tak začátek amplifikace. Reakce probíhá v teplotních cyklech, které jsou nejčastěji tříkolové – denaturace, připojení primérů, syntéza. Vznik produktu může být sledován plynule, nebo až po skončení reakce.
Kvantitativní PCR reverzní transkripce neboli RT-qPCR
Tato metoda se používá za předpokladu, je-li výchozím materiálem RNA. Při RT-qPCR je nejprve RNA přepsána do komplementární DNA reverzní transkriptázy (cDNA), nebo do messenger RNA (mRNA). CDNA se následně využije jako templát pro rekci qPCR. Kvantitativní PCR reverzní transkripci využijete v mnoha aplikacích, především pak v analýze genové exprese, při validaci RNAi, validaci microarray, detekci patogenů a v neposlední řadě i při genetickém testování a výzkumu onemocnění.
Veškeré pomůcky pro standardní, real-time, direct a hot start PCR si můžete rovnou objednat v našem eshopu, nebo prostřednictvím kontaktního formuláře pod tímto článkem.
Rozdíly mezi jednokrokovou a dvoukrokovou RT-qPCR
Výše vysvětlená RT-qPCR může být buď jednokroková, nebo dvoukroková. Jednokrokové kity kombinují reverzní transkripci a PCR v jedné jediné zkumavce a pufru. K tomuto procesu lze použít buď jeden enzym s reverzní transkriptázovou a polymerázovou aktivitou, nebo reverzní transkriptázu společně s DNA polymerázou. Jednokroková RT-qPCR využívá pouze sekvence specifických primerů. Oproti tomu dvoukroková RT-qPCR se provádí v oddělených zkumavkách s různými optimalizovanými pufry.
| Výhody jednokrokové RT-qPCR | Výhody dvoukrokové RT-qPCR |
|---|---|
| méně pipetovacích kroků sníží riziko kontaminace | cílové a referenční geny mohou být zesíleny ze stejné c DNA pool bez multiplexu |
| rychlá a vysoce reprodukovatelná | optimalizované reakční pufry a reakční podmínky mohou být použity pro jednotlivé reakce |
| vhodná pro vysoké propustnosti zesílení / screeningu | velmi flexibilní možnosti použití |
Důležité kroky při reverzní transkripci v RT-qPCR
1) Výběr celkové RNA versus mRNA
Jakmile začnete navrhovat test RT-qPCR, je důležité se rozhodnout, zda použijete celkovou RNA, nebo mRNA vyčištěnou jako templát pro reverzní transkripci. mRNA může poskytnout o něco větší citlivost, avšak nejčastěji se doporučuje zvolit za výchozí materiál spíše RNA, a to hned z několika důvodů:
- je zapotřebí méně čisticích kroků, což zajistí větší kvantitavní obnovení templátu a tím pádem také lepši schopnost normalizovat výsledky výchozího poču buněk
- vyhnete se obohacování mRNA a tím snížíte riziko zhoršení výsledků v důsledku odlišné výnosnosti obnovy
- celková RNA se doporučuje zejména proto, že realtivní kvantifikace cílů je důležitější než absolutní citlivost detection1
2) Výběr primerů pro reverzní transkripce
Pro základní cDNA reakci u dvoukrokových kitů lze použít tři různé přístupy: oligo (dT) primery, náhodné primery, nebo sekvence specifických primerů. Nejčastěji se používají první dvě varianty, tedy směs oligo (dT) a náhodné primery. V níže uvedené tabulce vidíte základní drhnutí a funkce všech 3 možných variant.
| Název varianty | Funkce | Doporučení |
|---|---|---|
| OLIGO (dT) PRIMERY | Oligo (dT) nasedají na poly (A) a zadní části mRNA, tím pádem lze reverzní transkripci začít od začátku na 3 'konci mRNA. | vhodné, pokud je k dispozici jen málo výchozího materiálu |
| NÁHODNÉ PRIMERY | O délce šest až devět bází, které nasedají na všechny RNA (tRNA, rRNA a mRNA) na více místech podél přepisu, vytváří cDNA populaci, která pokrývá celý přepis. | pokud je k dispozici málo výchozího materiálu, pro vysoký výnos z cDNA, ale cDNA je vyrobena ze všech RNA, což není vždy žádoucí |
| SEKVENCE SPECIFICKÝCH PRIMERŮ | Zakázková výroba. Jedná se o primery specifické pro mRNA požadovaného pro reverzní transkripci. Umožňují specifickou a citlivou generaci cDNA. | vhodné, pokud chcete snížit na pozadí základní nátěr a pokud chcete přepsat pouze konkrétní RNA |
Prohlédněte si seznam všech nabízených PCR, qPCR, RT-PCR a dNTPs
| Real-time PCR |
|---|
| Maxima® SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2x) |
| Maxima® Probe/ROX qPCR Master Mix (2x) |
| Maxima® SYBR Green qPCR Master Mix (2x), ROX Solution provided |
| Maxima® Probe qPCR Master Mix (2x), ROX Solution provided |
| Maxima® SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix (2x) |
| Direct PCR |
|---|
| Fast Tissue-to-PCR Kit |
| Hot Start PCR |
|---|
| Maxima® Hot Start Green PCR Master Mix (2x) |
| Maxima® Hot Start PCR Master Mix (2x) |
| Maxima® Hot Start Taq DNA Polymerase |
| TrueStart™ Hot Start Taq DNA Polymerase |
| Fast PCR |
|---|
| PyroStart™ Fast PCR Master Mix (2x) |
| High Fidelity PCR |
|---|
| Pfu DNA Polymerase |
| High Fidelity PCR Enzyme Mix |
| Long Range PCR |
|---|
| Long PCR Enzyme Mix |
| PCR Cloning |
|---|
| CloneJET™ PCR Cloning Kit |
| Reverse Transcription |
|---|
| Maxima® First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-qPCR |
| Maxima® Universal First Strand cDNA Synthesis Kit (pouze pro USA a Kanadu) |
| Maxima® Reverse Transcriptase |
| RevertAid™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit |
| RevertAid™ Premium Reverse Transcriptase |
| RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit |
| RevertAid™ H Minus Reverse Transcriptase |
| RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit |
| RevertAid™ Reverse Transcriptase |
| First Strand cDNA Synthesis Kit |
| M-MuLV Reverse Transcriptase |
| AMV Reverse Transcriptase |
| RiboLock™ RNase Inhibitor |
| Nucleotides and Primers |
|---|
| Aminoallyl-dUTP |
| Biotin-11-dUTP |
| dATP |
| dCTP |
| dGTP |
| dITP |
| dNTP Mixes |
| dNTP Set |
| dNTP/dUTP Mix |
| dTTP |
| dUTP |
| Exo-Resistant Random Primer |
| Fluorescein-12-dUTP |
| M13/pUC Sequencing Primers |
| Oligo(dT)18 Primer |
| pJET1.2 Sequencing Primers |
| Random Hexamer Primer |
| Transcription Promoter Sequencing Primers |
| Buffers and Reagents |
|---|
| 10x Taq Buffer with (NH4)2SO4 |
| 10x Taq Buffer with (NH4)2SO4 and 20 mM MgCl2 |
| 10x Taq Buffer with KCl |
|
10x Taq Buffer with KCl and 15 mM MgCl2 10x Taq Buffer without Detergent |
| 10x DreamTaq™ Buffer |
| 10x DreamTaq™ Green Buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) |
| DEPC-treated Water |
| Water, nuclease-free |