Rozdíly mezi jednokrokovou a dvoukrokovou RT-qPCR
Výše vysvětlená RT-qPCR může být buď jednokroková, nebo dvoukroková. Jednokrokové kity kombinují reverzní transkripci a PCR v jedné jediné zkumavce a pufru. K tomuto procesu lze použít buď jeden enzym s reverzní transkriptázovou a polymerázovou aktivitou, nebo reverzní transkriptázu společně s DNA polymerázou. Jednokroková RT-qPCR využívá pouze sekvence specifických primerů. Oproti tomu dvoukroková RT-qPCR se provádí v oddělených zkumavkách s různými optimalizovanými pufry.
Výhody jednokrokové RT-qPCR | Výhody dvoukrokové RT-qPCR |
---|
méně pipetovacích kroků sníží riziko kontaminace | cílové a referenční geny mohou být zesíleny ze stejné c DNA pool bez multiplexu |
rychlá a vysoce reprodukovatelná | optimalizované reakční pufry a reakční podmínky mohou být použity pro jednotlivé reakce |
vhodná pro vysoké propustnosti zesílení / screeningu | velmi flexibilní možnosti použití |
Důležité kroky při reverzní transkripci v RT-qPCR
1) Výběr celkové RNA versus mRNA
Jakmile začnete navrhovat test RT-qPCR, je důležité se rozhodnout, zda použijete celkovou RNA, nebo mRNA vyčištěnou jako templát pro reverzní transkripci. mRNA může poskytnout o něco větší citlivost, avšak nejčastěji se doporučuje zvolit za výchozí materiál spíše RNA, a to hned z několika důvodů:
- je zapotřebí méně čisticích kroků, což zajistí větší kvantitavní obnovení templátu a tím pádem také lepši schopnost normalizovat výsledky výchozího poču buněk
- vyhnete se obohacování mRNA a tím snížíte riziko zhoršení výsledků v důsledku odlišné výnosnosti obnovy
- celková RNA se doporučuje zejména proto, že realtivní kvantifikace cílů je důležitější než absolutní citlivost detection1
2) Výběr primerů pro reverzní transkripce
Pro základní cDNA reakci u dvoukrokových kitů lze použít tři různé přístupy: oligo (dT) primery, náhodné primery, nebo sekvence specifických primerů. Nejčastěji se používají první dvě varianty, tedy směs oligo (dT) a náhodné primery. V níže uvedené tabulce vidíte základní drhnutí a funkce všech 3 možných variant.
Název varianty | Funkce | Doporučení |
---|
OLIGO (dT) PRIMERY | Oligo (dT) nasedají na poly (A) a zadní části mRNA, tím pádem lze reverzní transkripci začít od začátku na 3 'konci mRNA. | vhodné, pokud je k dispozici jen málo výchozího materiálu |
NÁHODNÉ PRIMERY | O délce šest až devět bází, které nasedají na všechny RNA (tRNA, rRNA a mRNA) na více místech podél přepisu, vytváří cDNA populaci, která pokrývá celý přepis. | pokud je k dispozici málo výchozího materiálu, pro vysoký výnos z cDNA, ale cDNA je vyrobena ze všech RNA, což není vždy žádoucí |
SEKVENCE SPECIFICKÝCH PRIMERŮ | Zakázková výroba. Jedná se o primery specifické pro mRNA požadovaného pro reverzní transkripci. Umožňují specifickou a citlivou generaci cDNA. | vhodné, pokud chcete snížit na pozadí základní nátěr a pokud chcete přepsat pouze konkrétní RNA |
Prohlédněte si seznam všech nabízených PCR, qPCR, RT-PCR a dNTPs