Upravit stránku

Průkazy infekce koronavirem a jejich klinický a epidemiologický význam

V době, kdy vypukla koronavirová pandemie, jsme neměli dostatek znalostí pro správná rozhodnutí. Ačkoliv nyní máme znalostí více, stále narážíme na chybné informace pocházející z úst některých odborníků, které jsou pro laiky zavádějící. V tomto článku vám zkusíme ozřejmit, jaké testy se pro průkaz koronavirové infekce používají, jaká je jejich citlivost a u kterých dochází k falešně negativním výsledkům.

Stručná charakteristika onemocnění infekcí COVID-19

Onemocnění COVID-19 je infekční choroba, která je způsobená proniknutím příslušného viru do lidského organizmu. Nejčastější branou pro vstup infekce do těla je dýchací systém. Po vniknutí do cílových buněk se v nich virus množí do té doby, dokud se hostitelská buňka nerozpadne a neuvolní tak velké množství replikovaných virů dál do vnitřního prostředí lidského těla. Na tento proces reaguje imunitní systém tvorbou protilátek, které postupně virus likvidují. Převáží-li protilátková odpověď imunitního systému nad množením virových částic, dojde k vymizení viru z organizmu a jeho uzdravení. Pokud se rovnováha posune na stranu viru, může to mít za následek celkové selhání organismu.

Vlastnosti diagnostických testů

Abychom mohli průběh onemocnění úspěšně sledovat, byly vyvinuty diagnostické testy, které můžeme rozdělit podle několika parametrů:

  • podle fáze onemocnění, ve které je příslušný test vhodné použít
  • délky trvání testu, za jak dlouho můžeme odečíst výsledek
  • podle toho, zda chceme u pacienta indikovat přímo virovou agens nebo sledovat jeho imunitní odpověď

U jednotlivých testů je důležitá jejich přesnost — test nám odpoví jednoznačně a správně. K popsání kvality používáme termín citlivost (sensitivita) a specifičnost (jednoznačnost). Sensitivita vypovídá o míře správných pozitivních výsledků, specifičnost naopak o míře těch negativních.

Falešně negativní výsledky

Pro klinickou praxi a epidemiologické studie je jedním z nejdůležitějších parametrů testu výskyt falešně negativních výsledků. Ty by měly být minimální, nebo nejlépe nulové. Mezi citlivostí testu a výskytem falešně negativních výsledků je úzká závislost — čím je nižší citlivost testu, tím je výskyt falešné negativity pravděpodobnější.

1. Průkaz nákazy s přítomností koronaviru metodou PCR

Tento test je považovaný za nejpřesnější a jde také o referenční metodu. Nicméně i u PCR testu dochází k falešným pozitivitám. PCR testy vycházejí z izolace virové RNA ve vzorku a její převedení na DNA, která je dále namnožená polymerázovou reakcí. I tento velice přesný test však vykazuje falešně negativní výsledky. A to buď záhy po nakažení (v prvních dnech infekce), nebo později po prodělání onemocnění.

V prvních dnech po nákaze může být v analyzovaných vzorcích (stejně jako po prodělání infekce) velmi malé množství virových partikulí, takže je test není schopný identifikovat — falešná negativita z nedostatečné senzitivity.
Výskyt falešně negativních PCR testů ode dne nákazy (jistého, nebo předpokládaného) je na následujícím grafu převzatém z práce Kucirka a spol. (False negatives: how accurate are PCR tests for COVID-19? Coronavirus news, May 2020), a Ferranové (Coronavirus tests are pretty accurate, but far from perfekt https://theconversation.com/rapid-home-based-coronavirus-tests-are-coming-together-in-research-labs-were-working-on-analyzing-spit-using-advanced-crispr-gene-editing-techniques-138064)

2. Testy založené na genové editaci CRISPR

Vývoj diagnostických testů, které se zaměřují na přímý průkaz virových částeček ve vzorku, vedl k vytvoření testů založených na genové editaci (CRISPR). Tyto testy vynikají svojí rychlostí a vysokou senzitivitou. Dále mohou být uzpůsobeny pro použití v diagnostické laboratoři nebo v terénu.

Na principu CRISPR je založená metoda označovaná zkratkou SHERLOSCK (Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing). Jde o domácí verzi vyšetřování v podobě rychlotestu, která byla vyvíjená pod názvem CRISPR-ENHANCE skupinou vedenou PK Janinem (https://theconversation.com/rapid-home-based-coronavirus-tests-are-coming-together-in-research-labs-were-working-on-analyzing-spit-using-advanced-crispr-gene-editing-techniques-138064).

3. Test na průkaz bílkovinné součásti virové partikule

Mezi testy namířené na přímou detekci přítomnosti viru v odebraném vzorku (výtěr z nosohltanu) patří také testy, které prokazují bílkovinnou součást virové částice. Takovým testem je VivaDiag™ SARS-CoV-2 Ag Rapid Test vyráběný firmou VivaChek Laboratories Inc. Svým uspořádáním se testovací souprava podobá antigenním testům — destička s okénkem pro nanesení vzorku a okénkem pro odečtení výsledku. Avšak navzdory této podobnosti jde o zcela odlišný typ testu. 

test VivaDiag™ SARS-CoV-2 Ag Rapid Test

4. Antigenní testy

Druhou skupinou diagnostických testů jsou antigenní testy, které nedetekují přítomnost viru ve vzorku, ale odpověď imunitního systému na daný virus. Tyto testy vycházejí z tradičního pojetí vztahu mezi antigenem a protilátkou. Za předpokladu, že organizmus reaguje na přítomnost virových antigenů tvorbou protilátek, lze přítomnost antigenů považovat za důkaz, že se s virem organizmus setkal. V antigenních testech obvykle vyšetřujeme přítomnost protilátek třídy IgM a IgG

Protilátky se nejčastěji objevují v krvi pacienta až 10 den od vstupu infekce do organizmu a přetrvávají několik měsíců po prodělané chorobě. Tedy v době, kdy už nejsou virové partikule přítomné v organizmu. K průkazu těchto protilátek slouží rychlotesty, které jsou rychlé a výsledek poskytují během několika minut. Původní určení těchto testů bylo pro domácí testování. Nevyžadují žádné speciální zařízení, kromě běžných odběrových pomůcek. V případě rychlotestů je vzorkem obvykle kapka periferní krve.

Antigenní test sleduje reakci virového antigenu s imunitním systémem
Hodnocení antigenního testu

5. MLPA

Vedle testů založených na klasické polymerázové reakci (PCR), kdy cílová sekvence je namnožena termorezistentní polymerázou (Tag). Nedávno vyvinuté testy jsou založené na amplifikaci, která nevyžaduje cyklování denaturace dvouřetězcových molekul nukleových kyselin teplotou (dovolí připojení primerů na jednořetězcové molekuly), ale používá polymerázu, která pracuje při neměnné teplotě cca 65 °C — tzv multiplex ligation–dependent probe amplification (MLPA™). Tyto testy jsou dostatečně spolehlivé, vysoce citlivé a velice rychlé. Celý proces obvykle netrvá déle než 1 hodinu.

Zcela novým přístupem je momentálně sekvenace NGS na čipové platformě navržená firmou PARAGON GENOMICS pod názvem
CleanPlex®SARS-CoV-2 Research and Surveillance Panel for Illumina® (www.paragongenomics.com/cleanplex_technology/). Metoda je zatím určená pouze k výzkumným účelům a umožňuje určením sekvence nukleotidů téměř celého virového genomu identifikovat případné jeho mutace, a to i při nepatrném množství virových partikulí vstupujících do reakce. Vedle vysoké přesnosti vyniká tato metoda i schopností zpracovat velké množství vzorků. Podrobnosti o této metodě se dočtete na stránkách výrobce.


Je důležité, abychom si uvědomili, že prakticky žádný ze zmiňovaných testů není 100% spolehlivý, a to z několika důvodů.

1. Odstranitelné problémy jsou obvykle způsobeny:
  • Hledáme ve vzorku záchyt, který buď není ve vzorku přítomen, nebo je v tak nízké koncentraci, že spadá pod citlivost testu. Vyplývá to z toho, že jsme např. z hlediska průběhu onemocnění zvolili nevhodný test nebo nevhodnou dobu odběru.
  • Odběr a analýzu jsme provedli chybným způsobem. 
  • Výsledky špatně interpretujeme.
2. Neodstranitelné obvykle vyplývají z testu samotného – např. jsme pro danou situaci použili nevhodný či nekvalitní test.

Americká vláda vydala řadu dokumentů vztahujících se ke koronavirové pandemii prostřednictvím dvou institucí: CDC a FDA, z nichž vybíráme přehled o nabídce diagnostických testů a soubory často řešených otázek s jejich používáním.

Centersfor Disease Control and Prevention:How to Get CDC’s COVID-19 Diagnostic Test and Supplies (https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/virus-requests.html)

U.S. Food and Drug Administration:FAQs on Testing for SARS-CoV-2 (https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/faqs-testing-sars-cov-2).
 

Nahoru