Sangerovo sekvenování je vysoce efektivní metoda pro analýzu malých cílených genomických oblastí a validaci výsledků z NGS. Stejně jako u všech sekvenačních technologií však existují omezení a potřeba řešení problémů.
Základní kroky pro řešení problémů
Pokud váš vzorek neposkytuje požadovanou kvalitu čtení, doporučujeme začít těmito třemi kroky:
1. Návrh primerů
- Optimální délka: 18–24 bází
- Obsah GC: 45–55 %
- Teplota tání (Tm): 55–60 °C
2. Kontaminanty
- Zkontrolujte, zda eluce neobsahuje EDTA (např. TE pufr).
- Nízký poměr 260/230 (<1,6) naznačuje přítomnost organických kontaminantů.
- Důkladně odstraňte zbytky ethanolu při izolaci DNA.
3. Obtížné šablony
- GC-bohaté oblasti nebo sekundární struktury mohou negativně ovlivnit reakci.
- Pro obtížné šablony nabízíme speciální protokoly v USA i EU.
Omezení Sangerova sekvenování
1. Návrh primerů
- Kvalitní primery jsou klíčem k úspěchu.
- Nabízíme univerzální primery zdarma nebo nástroje pro výběr primerů v rámci vašeho účtu Azenta.
2. Koncentrace a objem vzorku
- Dodržujte doporučené koncentrace pro optimální výsledky.
- Nízká koncentrace negativně ovlivňuje efektivitu sekvenování.
3. Delší délky čtení = vyšší náklady
- Pro delší čtení doporučujeme využít Plasmid EZ (s ONT) pro nákladově efektivní sekvenování celých plazmidů.
Zlepšete své výsledky se službami GENEWIZ
Naše služby Sangerova sekvenování zahrnují:
- Přístup k univerzálním primerům a nástrojům pro jejich výběr.
- Technickou podporu od našich expertů.
- Možnosti řešení problémů s obtížnými šablonami.