Sangerovo sekvenování je zlatým standardem pro určování sekvence DNA. Společnost GENEWIZ nabízí spolehlivé a vysoce kvalitní služby Sangerova sekvenování pro výzkumníky po celém světě.
Zde jsou některé tipy a návod, jak získat ty nejlepší výsledky: 📝🧪
1. Příprava vzorku: Ujistěte se, že vaše DNA je čistá a bez kontaminací. Pro optimální výsledky použijte 10-20 ng/μl templátové DNA a 5-10 pmol/μl primeru. 🧫🔍 #SamplePrep #CleanDNA
2. Výběr primeru: Zvolte primer o délce 18-24 bází s teplotou tání (Tm) kolem 50-60°C. Vyhněte se primerům s vysokým obsahem GC a sekundárními strukturami. 🧬🌡️ #PrimerDesign #OptimalTm
3. Reakce: Pro každý vzorek připravte 10 μl reakční směsi obsahující DNA, primer a další komponenty podle protokolu GENEWIZ. Použijte kvalitní reagencie a dodržujte doporučené podmínky cyklování. 🧪🔄 #SequencingReaction #HighQualityReagents
4. Zkumavky a premix: GENEWIZ nabízí možnost objednat si předpřipravený sekvenační premix ve zkumavkách. Tento premix obsahuje všechny potřebné komponenty pro reakci, stačí přidat pouze vzorek DNA a primer. Použití premixu šetří čas a snižuje riziko chyb při přípravě reakce. 🧪💡 #SequencingPremix #TimeSaving
5. Příprava a odeslání vzorků:
PCR fragment: Pro sekvenování PCR fragmentu proveďte purifikaci produktu pomocí kolonky nebo enzymatické metody (ExoSAP-IT). Odešlete 10-20 ng/μl purifikovaného PCR fragmentu spolu s 5-10 pmol/μl primeru. 🧫🧪 #PCRCleanup #PurifiedSample
Plazmid: Pro sekvenování plazmidu proveďte izolaci a purifikaci plazmidové DNA pomocí komerčních kitů nebo alkalické lýzy. Odešlete 100-500 ng/μl purifikovaného plazmidu spolu s 5-10 pmol/μl primeru. Ověřte kvalitu a koncentraci plazmidové DNA spektrofotometricky nebo agarózovou elektroforézou. 🧬🔬 #PlasmidPrep #QualityControl
Vzorky odešlete do GENEWIZ v 96-jamkové destičce, 8-zkumavkovém stripu nebo jednotlivých zkumavkách s premixem. Řádně označte vzorky a vyplňte online formulář pro odeslání. 📥📊 #SampleSubmission #ProperLabeling
6 Troubleshooting:
Nízké signály: Zkontrolujte kvalitu a množství templátové DNA. Zvyšte koncentraci DNA nebo primeru, případně optimalizujte podmínky reakce (teplota nasedání primerů, počet cyklů). 📉🧪 #LowSignal #OptimizeConditions
Vysoké pozadí: Ověřte specifitu primeru a snižte jeho koncentraci. Optimalizujte teplotu nasedání primerů nebo použijte "hot start" polymerázu. Proveďte purifikaci produktu před sekvenováním. 🌫️🧬 #HighBackground #PrimerSpecificity
Chybějící báze: Zkontrolujte kvalitu a čistotu templátové DNA. Odstraňte inhibitory PCR (soli, ethanol, EDTA) purifikací nebo přesrážením. Ověřte kompatibilitu primerů a upravte jejich design. 🚫🧬 #MissingBases #RemoveInhibitors
Překrývající se signály: Optimalizujte množství templátové DNA a primeru. Proveďte purifikaci produktu před sekvenováním. V případě sekvenování plazmidu použijte alkalickou denaturaci a precipitaci. 🌪️🧫 #OverlappingSignals #PlasmidDenaturation
Pokud problémy přetrvávají, obraťte se na technickou podporu GENEWIZ pro další asistenci. 🆘📞 #TechnicalSupport #ExpertAdvice
7. Analýza výsledků:
Chromatogram: Zkontrolujte kvalitu chromatogramu, výšku a rozlišení píků, poměr signálu k šumu. Ověřte přesnost přiřazení bází a případné nejednoznačnosti. 📊🧬 #ChromatogramQuality #PeakResolution
Sekvence: Proveďte alignment získané sekvence s referenční sekvencí pomocí nástrojů jako BLAST nebo ClustalW. Identifikujte mutace, polymorfismy a chyby sekvenování. Ověřte čtecí rámec a přítomnost start/stop kodónů. 🧬💻 #SequenceAlignment #MutationDetection
Pokrytí a délka čtení: Zkontrolujte délku a kvalitu čtení v obou směrech. Ověřte, zda získaná sekvence pokrývá celou cílovou oblast. V případě potřeby proveďte dodatečné sekvenování s novými primery. 📏🧬
#ReadLength #SequenceCoverage
Hodně štěstí s vaším výzkumem a sekvenováním! 🍀🧬 #HappySequencing #AchievingExcellence