Substráty pro enzymy

5-Fluoroorotic acid (5-FOA)

Thermo Scientific 5-Fluoroorotic kyselina (monohydrát 5-fluorouracil-6-karboxylová kyselina, 5-FOA) se používá v kvasinkové molekulární genetice pro detekci exprese genu URA3, který kóduje orotin-5'-monofosfát (OMP) dikarboxylázu. Kvasinky s aktivním genem URA3 (Ura +) přeměňují 5-FOA na fluorodeoxyuridin, který je toxický pro buňky.

Kvasinkové kmeny nesoucí mutaci v genu URA3 rostou v přítomnosti 5-FOA, jestliže je médium doplněné o uracil. 5-FOA se často používá při pokusech se Saccharomyces cerevisiae (URA3), Schizosaccharomyces pombe (URA4 a URA5), Candida albicans (URA3) a E. coli (pyrF).

Aplikace

• Detekce URA3 genové exprese v kvasinkách.
• Konstrukce kvasinkových 2-hybridních knihoven.
• Další oblasti kvasinkové genetiky, včetně náhrady genů, analýzy transpozonových genetických elementů a identifikace mutací v genech.

NBT a BCIP

Thermo Scientific Pierce NBT a BCIP substráty jsou ve formě prášku nebo roztoku chlorid nitrotetrazoliové modři a 5-brom-4-chlor-3'-indolyfosfátu pro chromogenní bloty a IHC barvení se sondami s alkalickou fosfatázou.

Kombinací NBT (chlorid nitrotetrazoliové modři) a BCIP (5-brom-4-chlor-3'-p-toluidin indolyfosfátové soli) se získá intenzivní, nerozpustná černo-fialová sraženina při reakci s alkalickou fosfatázou, což je populární enzym konjugovaný s protilátkovými sondami. NBT a BCIP prášky jsou k dispozici samostatně nebo v roztocích pro přímé pohodlné použití (s a bez levamisol supresoru endogenní aktivity fosfatázy).

Funkce:

• AP substrát - pro detekci aktivity alkalické fosfatázy (alk-phos) na pevném médiu, včetně nitrocelulózových a PVDF membrán a fixovaných vzorků tkání.
• Chromogenní - nepotřebujete žádné speciální vybavení pro vizualizaci. Produkuje purpurově černou sraženinu, která se snadno fotografuje.
• Možnosti balení - jednotlivé NBT a BCIP prášky nebo předformulované roztoky připravené k použití (s nebo bez levamisol supresoru).

Přednosti NBT / BCIP roztoků:

• Nejlepší pro imunoblotovací aplikace
• Připravené k použití
• Citlivé s nízkým pozadím a minimální variabilitou mezi testy

IPTG

Thermo Scientific IPTG je isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid pro použití se substráty β -galaktosidázy, jako je X-Gal pro detekci exprese vektorů, plasmidů nebo DNA fragmentů, které obsahují reportérský gen.

Činidlo X-Gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktopyranosid) je chromogenní substrát pro beta-galaktosidázu, který poskytuje modrou sraženinu, je rozpustný v DMF a může být použit k detekci vektorů, plasmidů nebo DNA fragmentů, které obsahují gen pro β-galaktosidázu.

IPTG může být použit pro maximalizaci exprese genů v expresních vektorech. Při skríningu knihovny bakteriofága lambda pomocí protilátky může být pravděpodobnost úspěchu zvýšena tím, že se zabrání expresi fúzního proteinu, dokud jsou plaky dobře zavedené. Umístěním nitrocelulózového filtru, který obsahuje induktor IPTG, na destičku a pokračování růstu při teplotě 37 °C, exprese potenciálního β-galaktosidáza-cDNA fúzního proteinu může být indukována po 3-4 hodinách růstu plaku. Nitrocelulózový filtr se pak inkubuje s protilátkami. IPTG se také používá v kombinaci s X-Gal pro detekci aktivní β -galaktosidázy a je praktický i pro aplikace používající bakteriofágové M13 a Igt11 vektory.

Vlastnosti IPTG:

• X-Gal poskytuje intenzivní modrou sraženinou při detekci exprese β-galaktosidázy.
• Lze kombinovat s IPTG, a tak selektivně maximalizovat detekci β -galaktosidázy.

X-Gal

Thermo Scientific X-Gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galakto-pyranosid) je inertní chromogenní substrát pro beta-galaktosidázu, která hydrolyzuje X-Gal na bezbarvou galaktozu a 4-chlor-3- brom-indigo, tvořící intenzivní modrou sraženinu. Indukce genu lacZ pomocí IPTG vede k hydrolýze X-Gal a ke vzniku modrých kolonií.

X-Gal roztok je stabilní roztok filtrovaný přes 0,22 um membránu formulovaný pro přímé použití ve spojení s IPTG pro skrínink modro/bílých kolonií.

Aplikace

• Skrínink modro/bílých kolonií pro odlišení rekombinantních (bílé) od nerekombinantních (modré) kolonií.
• Vizualizace exprese beta-galaktosidázového reportérského genu v transfekovaných eukaryotických buňkách.
• Detekce aktivity beta-galaktosidázy v imunologických a histochemických metodách.

X-Gluc

Thermo Scientific X-Gluc (5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-glukuronová kyselina, cyclohexylammonium sůl) je substrátem pro beta-glukuronidázu (GUS), která je kódována gusA, což je široce používaný reportérský gen. Glukuronidáza štěpí X-Gluc a vzniká bezbarvá kyselina glukuronová a intenzivní modrá sraženina chlor-bromoindiga.

Aplikace

• Detekce exprese GUS v rostlinných buňkách a tkáních.
• Detekce infekcí způsobených bakterií E. coli.
• Detekce bakteriální kontaminace ve vzorcích potravin a vody.