Připravili jsme pro vás podrobný návod na konstrukci genomových DNA knihoven pro sekvenování na systémech Ion Personal Genome machine a Ion Proton.
Hledaný výraz musí mít více jak 2 znaky.
Připravili jsme pro vás podrobný návod na konstrukci genomových DNA knihoven pro sekvenování na systémech Ion Personal Genome machine a Ion Proton.
Thermo Scientific MuSeek Library™ Preparation Kit pro Ion Torrent™ je určen pro konstrukci vysoce kvalitních genomových DNA knihoven pro sekvenování na systémech Ion Personal Genome Machine™ (PGM™) a Ion Proton™. Rychlý protokol využívá enzym MuA transpozázu, která katalyzuje současně fragmentaci cílové dvouřetězcové DNA a označení konců fragmentů transpozónovou DNA. V následném kroku PCR jsou adaptéry specifické pro danou platformu přidány pomocí robustní a přesné Thermo Scientific Phusion™ High-Fidelity DNA polymerázy. Stejný protokol může být použit pro konstrukci knihovny s 100-400bp inserty při použití pouze 100ng výchozího vzorku.
Kit obsahuje reagencie dostatečné pro 10 fragmentací a následných PCR reakcí. Kit obsahuje také MuA specifický sekvenační primer, který je potřeba pro PGM sekvenování, když jsou touto metodou připraveny knihovny bez čárového kódu.Schéma pracovního postupu:
MuA transpozáza je enzym (75 kDa) pocházející z bakteriofága Mu a je produkován jako rekombinantní protein v E. coli. Za vhodných podmínek MuA transpozáza tvoří homotetramerický komplex se dvěma 50 bp konci dvouvláknové DNA transpozónu, který obsahuje specifickou MuA vazebnou sekvenci. Po fragmentační reakci jsou konce cílové DNA označeny sekvencemi transpozónu.
PGM-specifické adaptéry jsou připojeny k fragmentům v následující adaptér-adiční PCR reakci. Nejprve 3'-konce fragmentované cílové DNA jsou prodlouženy přes 5nt mezer, které vznikly transpozicí, a poté je DNA prodloužena o transpozónové sekvence. V počátečních cyklech PCR, prvních 16nt na 3'-konci adaptéru, hybridizuje s transpozónovou sekvencí v prodloužených DNA fragmentech. V pozdějších cyklech PCR jsou fragmenty amplifikovány pomocí dvojice vnějších primerů.
TCAG oblast je klíčová sekvence (čtyři různé báze), která se používá pro kalibraci přístroje Ion Torrent. Sekvenační čtení začíná za klíčovou sekvencí a když je dosaženo konce fragmentu, čtení vstoupí do TGAA sekvence transpozónu. Sekvence odpovídající primeru A´ a komplementární k primeru P´ jsou znázorněny kurzívou.
MuSeek Library Preparation Kit pro Ion Torrent™ lze použít pro konstrukci DNA knihoven s čárovým kódem, ale musí být použity v kombinaci MuSeek Barcode Set 1 (Ion Torrent™ compatible) (Cat #K1541). MuSeek Barcode Set 1 (Ion Torrent ™ kompatibilní) poskytuje 1-16 MuSeek adaptor-primer směsí s čárovým kódem, z nichž každý umožňuje připojení unikátní Ion Torrent PGM™ - kompatibilní sekvence čárového kódu. Toto umožňuje výzkumníkům spojit až 16 knihoven před výběrem velikosti a emulzní PCR, a pak provést multiplexní sekvenování.
Pro sekvenování knihoven bez čárových kódů, vytvořených pomocí tohoto kitu, používejte pouze MuSEEK sekvenační PRIMER dodávaný v tomto kitu! Pro sekvenování knihoven s čárovým kódem, vytvořených pomocí tohoto kitu, používejte vždy pouze originální sekvenační primer dodávaný v LIFE TECHNOLOGIES ION sekvenačním kitu! Sekvenační data nebudou generována při ION sekvenování, pokud použijete špatné primery, neboť vazebná místa primerů jsou odlišná pro knihovny bez a s čárovým kódem.
1. Napipetujte všechny reagencie, s výjimkou MuSeek Enzyme Mix, v daném pořadí do tenkostěnné 0,5 ml zkumavky. Udržujte směs na ledu. Směs promíchejte krátce na vortexu a důkladně centrifugujte.
Složka | Objem |
---|---|
Nuclease-free Water | do 30.0 μL |
MuSeek Fragmentation Reaction Buffer | 10.0 μL |
gDNA | X μL (100 ng) |
MuSeek Enzyme Mix | 1.0 μL |
Celkem | 30.0 μL |
2. Pro úspěšnou fragmentaci DNA zabraňte pěnění reakční směsi! Před začátkem zapněte vortex na maximální rychlost. Přidejte MuSeek Enzyme Mix do ostatních složek reakce a promíchejte dotykem vortexu (pětkrát pokaždé na 1 sekundu), krátce centrifugujte. Ihned zkumavku inkubujte 5 minut při teplotě 30 °C. Doporučujeme vzorek inkubovat ve vodní lázni pro rychlejší přenos tepla. Co nejdříve vraťte MuSeek Enzyme Mix do mrazáku -70 °C
3. Zastavte reakci po 5 minutách přidáním 3ul MuSeek Stop roztoku a krátce vortexujte.
4. Po vortexování udržujte zkumavku při pokojové teplotě. Nedávejte reakční zkumavku na led, Stop roztok může způsobit vysrážení.
5. Proveďte purifikaci fragmentované DNA pomocí Agencourt™ AMPure™ XP PCR Purification system. Tento kit je navržen pro práci s Agencourt ™ AMPure ™ XP PCR purifikačním systémem, a proto nedoporučujeme používat jiné systémy pro izolaci. Inkubujte magnetické kuličky při pokojové teplotě alespoň 30 minut před zahájením purifikace a před pipetováním dobře promíchejte.
1. Vezměte 20 ul přečištěné fragmentované DNA z kroku čištění (popsán výše) a přidejte do reakční směsi (1,5 ml zkumavka) při pokojové teplotě:
Složka | Objem |
---|---|
Voda bez nukleáz | 72 μL |
MuSeek Adaptor Addition Reaction Buffer | 100 μL |
MuSeek Adaptor Addition Primer Mix NEBO Selected MuSeek Barcode Adapter Primer Mix 1-16 z Thermo Scientific MuSeek Barcode Set 1, Ion Torrent compatible (Cat #K1541) | 4 μL |
Purifikovaná fragmentovaná DNA | 20 μL |
Phusion Hot Start II High-Fidelity DNA Polymerase | 4 μL |
Celkem | 200 μL |
2. Rozdělte reakční směs do čtyř samostatných 200ul PCR zkumavek (u některých termocyklerů se nedoporučuje amplifikovat DNA v reakčním objemu vyšším než 50ul).
3. Proveďte PCR ve všech čtyřech reakčních směsích podle následujících podmínek:
Teplota | Čas | Cykly |
---|---|---|
66 °C | 3 min | 1 |
98 °C | 30 sec | 1 |
98 °C | 10 sec | 8 |
60 °C | 50 sec | 8 |
72 °C | 10 sec | 8 |
72 °C | 1 min | 1 |
4 °C | hod |
4. Spojte všechny čtyři reakce do jedné 1,5 ml zkumavky a proveďte purifikaci DNA pomocí Agencourt AMPure XP PCR purifikačního systému:
Knihovny připravené pro sekvenování pomocí MuSeek Library Preparation Kit pro Ion Torrent™ obsahují DNA fragmenty o délce ~ 150 - 1 500bp. Každý fragment obsahuje adaptérovou sekvenci na obou koncích, celkově 93bp u knihoven bez čárového kódu. Při výběru velikosti knihovny pro příslušnou délku sekvenačního čtení musíte brát v úvahu délku adaptérů. Výběr správné velikosti píku u DNA knihovny ukazuje následující tabulka.
Pro provedení efektivní emulzní PCR a následné sekvenační reakce doporučujeme výběr velikosti na systému E-Gel® Agarose Gel Electrophoresis s použitím E-Gel® SizeSelect™ 2% Agarose Gel. Návod naleznete na www.lifetechnologies.com. Odeberte 1ul finální knihovny pro analýzu distribuce velikostí fragmentů a stanovení koncentrace pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer.
Shromážděte všechny vzorky uložené z fragmentační reakce, z PCR připojení adaptérů a z výběru velikosti pro analýzu pomocí přístroje Bioanalyzer Agilent 2100. Před zahájením nařeďte vzorky po fragmentační reakci 2 - krát a vzorky po PCR připojení adapterů 4 - krát. Vzorky po E- Gel ® výběru velikosti nesmí být ředěny. Analyzujte všechny vzorky dohromady na Bioanalyzer 2100 pomocí kitu High Sensitivity DNA (Cat #5067-4626).
Smíchejte všechny knihovny s čárovými kódy ve stejném molárním množství před E - Gel výběrem velikosti tak, aby konečný objem směsi byl větší než 25ul. Doporučujeme výpočet molarity jednotlivých knihoven pouze v cílových intervalech, které jsou odlišné pro 100-400 bp knihovny (viz tabulka), jako například pro 200 bp čtení, vypočítejte molaritu v oblasti 297 až 363 bp, což odpovídá následnému výběru velikosti cílového píku (± 10 %).
Distribuce velikostí fragmentů byla analyzována na Agilent 2100 Bioanalyzer pomocí kitu High Sensitivity DNA (Life Technologies). Červená - 2násobné ředění DNA fragmentů po fragmentační reakci; modrá - 4násobné ředění DNA fragmentů po PCR připojení adaptérů; zelená - fragmenty po výběru velikosti na E-Gel® Agarose Gel Electrophoresis Systemu s použitím E-Gel® SizeSelect™ 2% Agarose Gel.
Fragmenty knihovny připravené tímto kitem nesou čtyři báze MUA transpozónové sekvence bezprostředně za klíčovou sekvencí. Abyste získali co nejlepší výsledky z vašeho PGM běhu, musí být tyto báze odříznuty.
Pro sekvenční analýzy s Torrent Browser 3.0 (nebo novější) použijte templát dodávaný v tomto kitu (MuSeek Library Template) při plánování běhu sekvenování. Templát se nachází na stránce templátu, která je pod záložkou Plan tab. Tento templát má výchozí nastavení, které identifikuje MuSeek 3 ´adaptér (MuSeek/P1B) a 5' tag sekvenci (MuSeek_5prime_tag), které budou odříznuty při zpracování dat.
Návod pro nahrání sekvencí čárových kódů naleznete v dokumentaci Torrent Browser 3.0 dostupné na http://ioncommunity.lifetechnologies.com.