Upravit stránku

Značení a detekce nukleových kyselin

Abychom nukleové kyseliny (NK) během práce s nimi mohli sledovat, obvykle je určitým způsobem označíme, což umožňuje jejich následnou vizualizaci. Typy značení lze rozdělit do dvou skupin (radioaktivní a neradioaktivní).

  •  Radioaktivní značení patří mezi nejstarší typy značení a nyní se používá velice zřídka. Je založeno na výměně neradioaktivních nukleotidů za nukleotidy obsahující některý z radioizotopů nejčastěji 32P, 33P nebo 35S.
  • Neradioaktivní značení - používáme fluorescenční nebo nefluorescenční značky, které se váží na molekuly nukleových kyselin. Dále se rozděluje na:
Infobox
  1. přímé značení - nukleotidy s navázaným fluorescenčním barvivem jsou přímo inkorporovány do řetězce NK během jeho syntézy (např. při amplifikaci nebo reverzní transkripci) 
  2. nepřímé značení - do řetězce NK jsou inkorporovány nukleotidy obsahující vazebný protein, který se během následné detekce váže s partnerskou molekulou (protilátkou, ligandem či jiným proteinem s vysokou afinitou), která je konjugovaná s fluorescenčním barvivem (dochází k emisi fluorescenčního záření) nebo s enzymem (např. alkalická fosfatáza nebo křenová peroxidáza), který zprostředkuje tzv. chemiluminiscenci (světélkování).

Průběžné a koncové značení NK

Nukleové kyseliny jsou nejčastěji značeny enzymaticky a k inkorporaci značky dochází buď po celé délce řetězce (průběžné značení), nebo na jeho konci (koncové značení). Pro průběžné značení jsou nejvíce používány tyto enzymy:

  • DNA polymerázy - katalyzují syntézu DNA 
  • reverzní transkriptázy - katalyzují přepis RNA na cDNA 
  • RNA polymerázy - katalyzují přepis cDNA na cRNA tzv. in vitro transkripce

Při koncovém značení jsou značené nukleotidy připojeny na 3’ nebo 5’ konec řetězce NK. Pro tento způsob značení jsou využívány hlavně tyto enzymy:

  • DNA/RNA ligázy - připojují značené nukleotidy na 3´konec DNA/RNA 
  • terminální deoxynukleotidyl transferáza (TdT) - připojuje značené nukleotidy na 3´konec DNA
  • polynukleotid kináza (PNK) - připojuje značené nukleotidy na 5´konec DNA/RNA

Biotin Chromogenic Detection Kit

Thermo Scientific Biotin Chromogenic Detection Kit je vhodný nástroj pro chromogenní detekci biotinylovaných sond. Kit je optimalizován tak, aby reprodukovatelně zajistil vysokou citlivost s nízkým pozadím v aplikacích, jako jsou například Southern, Northen, dot a slot bloty, a skríning virových plaků a bakteriálních kolonií. Biotinylace DNA/RNA sond je široce používána jako bezpečná a pohodlná alternativa k radioaktivnímu značení. Biotin může být začleněn do nukleových kyselin za použití různých enzymatických nebo neenzymatických metod, jako je Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit.

Vlastnosti kitu

Biotinylované sondy jsou detekovány streptavidinem konjugovaným s alkalickou fosfatázou (AP). Streptavidin-AP konjugáty se specificky a nevratně váží na sondy značené biotinem. Sondy jsou pak vizualizovány za použití chromogenního substrátu BCIP/NBT pro alkalickou fosfatázu, který produkuje modro-fialovou sraženinu. Vizualizace NK nevyžaduje použití rentgenového filmu nebo jiné zvláštní vybavení.

Výhody kitu

  • Vysoká citlivost detekce - 0,03 pg homologní DNA u dot blot hybridizace s biotinylovanou sondou.
  • Nízké pozadí díky optimalizovanému postupu odmývání a blokování.
  • Neradioaktivní vizualizace nevyžaduje rentgenový film nebo jiné zvláštní vybavení.
  • Rychlé a pohodlné – složky jsou pro přímé použití (ready-to-use).

Aplikace

Southern, Northen, dot a slot bloty, skríning virových plaků a bakteriálních kolonií.

Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit

Thermo Scientific Biotin DecaLabel DNA Labeling Kit je moderní systém pro efektivní syntézu DNA sond značených biotinem. Je založen na zlepšené metodě značení pomocí náhodných primerů (random primers), která byla vyvinuta podle Feinberga a Vogelsteina. Primární zlepšení oproti tradiční metodě random-primer značení je použití náhodných dekamerů místo hexamerů, což zajišťuje efektivnější hybridizaci primerů s DNA při teplotě 37 °C.

Klenowův Fragment, exo-, který je součástí kitu, je geneticky modifikovaný enzym s nulovou exonukleázovou aktivitou. Enzym proto nedegraduje značené sondy v průběhu reakce, což má za následek vysoký výtěžek značení i s nízkým množstvím templátu. Můžete jednotně označit všechny fragmenty DNA jakékoliv délky.

Výhody kitu

  • Neradioaktivní značení DNA.
  • Efektivní hybridizace s náhodnými dekamery.
  • Vysoké výtěžky s použitím Klenowova fragmentu, exo-. Nedochází tak k degradaci značené sondy v průběhu reakce.

Aplikace

Tvorba DNA sond značených biotinem pro různé experimenty zahrnující neradioaktivní hybridizaci, včetně Southern a Northern blotů, hybridizace kolonií / plaků, dot / slot blotů, in situ hybridizace.

DecaLabel DNA Labeling Kit

Thermo Scientific DecaLabel DNA Labeling Kit je moderní systém pro rychlou syntézu radioaktivně značených DNA sond s vysoce specifickou aktivitou. Kit je založen na zlepšené metodě značení pomocí náhodných primerů (random primers), která byla vyvinuta podle Feinberga a Vogelsteina.

Primární zlepšení oproti tradiční metodě random-primer značení je použití náhodných dekamerů místo hexamerů, což zajišťuje efektivnější hybridizaci primerů s DNA při teplotě 37 °C. Klenowův Fragment, exo-, který je součástí kitu, je geneticky modifikovaný enzym s nulovou exonukleázovou aktivitou. Enzym proto nedegraduje značené sondy v průběhu reakce, což má za následek vysoký výtěžek značení i s nízkým množstvím templátu. Můžete jednotně označit všechny fragmenty DNA jakékoliv délky. Dvě značící směsi jsou dodávány pro flexibilní použití buď radioaktivně značeného dATP nebo dCTP.

Výhody kitu

  • Vysoce specifické radioaktivní sondy - větší než 1 x 109 dpm / ug DNA.
  • Rychlé - 5 minut při teplotě 37 °C.
  • Vysoké výtěžky s použitím Klenowova fragmentu, exo-. Nedochází tak k degradaci značené sondy v průběhu reakce.
  • Flexibilní - vhodné pro radioaktivně značené dATP nebo dCTP.

Aplikace

Tvorba radioaktivně značených DNA sond pro různé experimenty zahrnující hybridizaci: Southern a Northern bloty, hybridizace kolonií / plaků, dot / slot bloty, in situ hybridizace.

Nahoru