Polymerázy

Polymerázy jsou enzymy, které syntetizují nukleové kyseliny, a to postupným připojováním nukleotidů k 3´OH konci předchozího nukleotidu. Pro zahájení syntézy většina polymeráz vyžaduje tzv. primer, což je krátký oligonukleotid, který tvoří začátek syntézy.

Polymeráza prodlužuje primer podle matrice (tzv. templát) ve směru 5' → 3'. Templátem může být jednořetězcová DNA nebo RNA. Některé polymerázy umí také štěpit řetězec od 3’ nebo 5′ konce tzv. 5’→3′ nebo 3’→5′ exonukleázová aktivita.

Polymerázová a exonukleázová aktivita DNA polymeráz
Polymerázová a exonukleázová aktivita DNA polymeráz (www.labguide.cz)
Polymerázy dle templátu Aktivita Využití Poznámky
DNA-dependentní DNA polymerázy
DNA polymeráza I (E.coli) 5' → 3' polymerázová
3' → 5' exonukleázová 
5' → 3' exonukleázová
  • syntéza DNA, cDNA
  • značení DNA „nick-translací“
  • modifikace konců rekombinantních molekul DNA
Degradace DNA ve směru 5´ → 3´a současná syntéza degradovaného řetězce, oprava chybně začleněných nukleotidů in vivo („proof-reading“)
Klenowův fragment DNA polymerázy I  5' → 3' polymerázová
3' → 5' exonukleázová 
  • syntéza dsDNA z jednořetězcových templátů
  • doplnění zkrácených 3´ konců DNA: tvorba tupých 
  • odstranění převisů na 3´ konci
Vzniká odstraněním s -koncové části DNA polymerázy I štěpením subtilisinem. 
T4 DNA polymeráza (Bakteriofág T4) 5 ´ → 3 ´ polymerázová
silná 3 ´ → 5 ´ exonukleázová
  • značení 3´ konců DNA nahrazovací reakcí
  • tvorby tupých konců
Exonukleázová aktivita 200 x vyšší než u Klenowova enzymu.
T7 DNA polymeráza (Bakteriofág T7)

5' → 3' polymerázová
3' → 5' exonukleázová 

  • sekvenování DNA
  • syntéza druhého vlákna cDNA
Vysoká procesivita, syntéza dlouhých úseků DNA.
Taq DNA polymeráza (Thermus aquaticus)

5' → 3' polymerázová
5' → 3' exonukleázová

  • PCR
Termostabilní, maximální aktivita mezi 70-80°C, tvorba dimerů primerů a dalších nežádoucích produktů.
Terminální deoxynukleotidyltransferáza (TdT) (telecí brzlík) přidávání dNTP k 3’- konci ssDNA a dsDNA 
  •  5′-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)
Syntéza bez templátu.
RNA-dependentní DNA polymerázy
Reverzní transkriptáza (retroviry M-MuLV,
AMV, RSV)
5 ´ → 3 ´ polymerázová
5´ → 3´exoribonukleázová
3 ´ → 5 ´exoribonukleázová a endoribonukleázová (RNáza H)

 
  • syntéza cDNA
  • RT-PCR
 
 
RNáza H degraduje RNA z hybridů RNA -DNA, které vznikají při reverzní transkripci. Umí katalyzovat i syntézu druhého vlákna DNA. 
DNA-dependentní RNA polymerázy
T3/T7 RNA polymeráza 
(Bakteriofág T3/T7)
 
  • transkripce in vitro
  • značení RNA
  • příprava templátu pro translaci in vitro
 
Poly(A) polymeráza přidává cca 200 A na 3´konec mRNA 
  • syntéza cDNA
 

 

Nukleázy

Nukleázy jsou enzymy degradující nukleové kyseliny neboli katalyzují rozštěpení fosfodiesterové vazby. Nukleázy štěpící nukleové kyseliny uvnitř řetězce se označují jako endonukleázy. Nukleázy štěpící nukleové kyseliny od konců se označují jako exonukleázy. Dle substrátu dále rozlišujeme deoxyribonukleázy štěpící DNA a ribonukleázy štěpící RNA.

Dle substrátu Substrát / aktivita Využití Poznámky
Deoxyribonukleázy
Deoxyribonukleáza I (DNáza I) 
(kravská slinivka)

ssDNA, dsDNA 
nespecifická endonukleáza
vytváří jednořetězcové zlomy

  • zavádění jednořetězcových zlomů v dsDNA před značením „nick translací“ 
  • degradace DNA ve vzorcích RNA
Citlivá na mechanické poškození.
Nukleáza Bal31 (Alteromonas espejiana)

lineární dsDNA
5' → 3' exonukleázová 
3' → 5' exonukleázová 

  • zkracování obou konců dsDNA 
  • odstranění restrikčních míst 
  • zavádění delecí
Generuje tupé konce.
Nukleáza S 
(Aspergillus oryzae)
ssDNA 
specifická endonukleáza 
  • odstranění jednovláknových struktur z dsDNA a RNA (nespárovaných smyček) 
  • mapování intronů analýzou hybridních molekul DNA-mRNA 
  • odstranění jednořetězcových konců DNA: tupé konce
 
Nukleáza ExoIII (E.coli) dsDNA s tupými konci nebo 5´ převisy
odbourává 5´ mononukleotidy z 3´ OH konce 
  • vytváření jednosměrných delecí od konců lineárních fragmentů DNA 
  • příprava jednořetězcových substrátů pro Sangerovo sekvenování 
Inaktivní na ssDNA
Lambda exonukleáza (Bakteriofág lambda) dsDNA
odstraňuje 5´ mononukleotidy 
ve směru 5´→ 3
  • vytváření jednosměrných delecí
Preferuje dsDNA fosforylovanou na 5´ konci.
Ribonukleázy
Ribonukleáza T1 (Aspergillus oryzae) štěpí specificky RNA v místech G
  • sekvenování RNA 
  • mapování RNA 
  • studium struktury RNA
RNáza H degraduje RNA z hybridů RNA -DNA, které vznikají při reverzní transkripci.
Ribonukleáza A 
(kravská slinivka)
štěpí specificky ssRNA v místech C a U
  • odstranění kontaminující RNA
  • mapování mutací v DNA nebo RNA štěpením nespárovaných oblastí
Degraduje RNA do 3 ´ -fosforylovaných oligonukleotidů.

 

ANCHOR_TOP_TITLE

Tento web využívá cookies

Pro chod webu jsou nezbytně aktivovány esenciální soubory cookies. Pro plnohodnotné poskytování služeb, personalizaci reklam a analýzu návštěvnosti jsou však nutné povolit i volitelné cookies. Kliknutím na následující tlačítko, je zapnete. Zobrazit podrobnosti

Nastavení cookies

Vaše soukromí je důležité. Můžete si vybrat z nastavení cookies níže. Zobrazit podrobnosti