Elektroforéza je metoda pro separaci molekul s rozdílnou hmotností či s odlišným elektrickým nábojem v elektrickém poli. Elektroforéza je založena na schopnosti nabitých částic pohybovat se v elektrickém poli, přičemž rychlost pohybu částic je závislá na velikosti celkového povrchového náboje, velikosti a tvaru molekuly a její koncentraci v roztoku.
Pro separaci nukleových kyselin se nejčastěji používá gelová elektroforéza. Nukleové kyseliny nesou záporný náboj a v zásaditém prostředí se pohybují v elektrickém poli od katody k anodě. Gely tvoří poměrně hustou trojrozměrnou síť, kterou větší molekuly procházejí pomaleji než menší molekuly (tzv. molekulové síto). Nejčastější gely jsou agarózový a polyakrylamidový.
Agarózový gel pro elektroforézu NK
Agaróza je lineární sacharidový polymer D-galaktosidázy a 3,6-anhydro-L-galaktopyranozy. Pro elektroforézu nukleových kyselin se používají gely obsahující 0,5 až 4 % agarózy. Čím je obsah polysacharidu vyšší, tím je lepší separační (rozlišovací) schopnost gelu, ale tím je také průběh elektroforézy pomalejší a příprava gelu je technicky náročnější.
Lineární molekuly polyakrylamidu vznikají polymerací akrylamidu a spojují se příčnými můstky, které vznikají kopolymerací s N,N‘-methylenbisakrylamidem. Do gelové směsi se ještě přidávají katalyzátory polymerace peroxydisíran amonný (APS) a N,N,N‘,N‘-tetramethylethylendiaminu (TEMED). Polyakrylamidová síť je poměrně hustá, a proto se hodí pro separaci kratších fragmentů (cca< 200bp). Koncentrace polyakrylamidového gelu pro separaci nukleových kyselin se většinou pohybuje od 3 do 20 %.
Nahlédněte do přehledného protokolu, ve kterém prezentujeme přesný postup elektroforézy nukleových kyselin za pomoci agarózových tablet TopVision.
Jak používat gel na eleketroforézu
Vzorky DNA/RNA se nanáší do jamek v gelu, které byly vytvořeny pomocí tzv. hřebínku. Aby vzorky nevyplavaly z jamek ven, jsou smíchány s tzv. nanášecím pufrem (loading dye /bufer), který obsahuje i barvivo pro kontrolu vložení vzorku do příslušné jamky a také pro sledování migrace v gelu. Nanášecí pufr většinou obsahuje glycerol pro pokles vzorků na dno jamek a bromfenolovou modř a xylen cyanol pro vizualizaci. Pro odhad velikosti separovaných DNA/RNA fragmentů se do jedné jamky gelu nanáší tzv. velikostní marker (hmotnostní standard, DNA/RNA ladder = žebřík) s definovanou velikostí jednotlivých fragmentů.
Mobilita při elektroforéze je ovlivněna složením elektroforetického pufru, a to především obsahem solí. Bez přítomnosti solí je elektrická konduktivita minimální a DNA se pohybuje jen velmi stěží.
Pro agarózovou elektroforézu se standardně používají tyto pufry
|
Pufr TAE poskytuje rychlejší elektroforetickou separaci lineárních molekul a lepší rozlišení superspiralizované nukleové kyseliny. |
Pufr TBE má silnější pufrovací kapacitu při déle trvajících elektroforézách či elektroforézách běžících při vysokém napětí. Při separaci v polyakrylamidovém |
Optimální velikost elektrického napětí při elektroforéze se udává jako 5-8 V/cm mezi elektrodami u agarózové elektroforézy a 1-8 V/cm u polyakrylamidové elektroforézy.
Pro viditelnost fragmentů DNA/RNA použijte UV transluminátor
Po skončení elektroforézy je nutné separované fragmenty DNA/RNA zviditelnit. Proto se do gelu přidávají barviva, která se vážou na nukleové kyseliny (např. ethidiumbromid nebo SYBR Green) a jsou viditelné při osvícení UV zářením v přístroji zvaném UV transluminátor. Další možností detekce je například blotting na membránu a následné obarvení nukleových kyselin, hybridizace se značenými sondami nebo u polyakrylamidového gelu je časté stříbření. Separované fragmenty nukleové kyseliny lze také z gelu izolovat a použít pro další analýzy.
Všechny reagencie, velikostní markery a barviva potřebné pro elektroforézu naleznete v našem e-shopu. Navíc zde naleznete TopVision agarózové tablety pro pohodlnou přípravu gelu bez nutnosti vážení prašné agarózy.