Molekulární klonování, jedna z nejstarších metod rozmnožování vybraných úseků DNA, představuje i dnes nejčastější způsob reprodukce DNA. Jedná se několikafázový proces, v němž Vám poslouží naše laboratorní kity a systémy. Tyto kity do České republiky dováží výhradně naše společnost Biogen. Informujte se o rychlých a účinných procesech klonování a objevte fantastické možnosti, které Vám jednotlivé sety nabízí.
Technika LIC
Ne všechny úseky lidské DNA vlastní cílová místa pro některý ze známých restrikčních enzymů. Existují úseky, kde by se mohla vyskytovat variabilita či mutace, respektive nějaká změna DNA, ale v okolí není žádná sekvence vhodná pro restrikci. Východiskem z takové situace může být technologie ligation-independent cloning (LIC) a systémy, které na principu LIC pracují. Tyto systémy umožňují klonovat jakýkoliv fragment a začlenit ho do libovolného místa v linearizovaném expresním vektoru, a to bez ohledu na enzymatickou restrikci.
S výběrem vhodného kitu vám rádi pomůžeme, stačí nás jen kontaktovat.
Novinkou na českém trhu v souvislosti s technikou LIC jsou kity (systémy) řady ALICator pro ligačně nezávislé klonování. Jednotlivé buňky pak snáze a účiněji produkují velké množství identických klonů a analýza ve finále poskytuje robustní, přesné a reprodukovatelné výsledky. Jedná se o relativně nový produkt, který eliminuje přísné podmínky ligace a redukuje potřebu restrikčních enzymů (restriktáz). Navíc je celá analýza také dostatečně rychlá. Příkladem může být ALICator™ LIC Cloning a Expression Kit s vysokou účinností klonování - více než 95%.
Kity využívají T4 DNA polymerázu, která umožní vytvořit specifické přesahující sekvenace o velikosti 14-21 nukleotidů, a to při běžné pokojové (laboratorní) teplotě. Vyšší teplota není třeba díky kvalitnímu štěpení restrikčními enzymy. Celý proces navíc trvá pouze cca 15 minut. Výhodné je i to, že systémy obsahují více bakteriálních vektorů, přičemž pro efektivní a rychlé klonování je dobré sledovaný element začlenit nejdříve do všech těchto expresních vektorů, určit jeden nejvíce kompatibilní a ten zvolit pro další výzkum.
TA cloning
Proces klonování může být ještě rychlejší a více účinný, například při použití kitů CloneJET PCR Cloning Kit nebo InsTAclone PCR Cloning Kit. Tyto výrobky pracují technikou TA klonování, stojící na schopnosti adeninu (A) a thyminu (T) spolu ligovat, neboli spojovat se. Vazba především tupých konců (ale mohou být takto spojeny i konce lepivé) vzniká prostřednictvím jednoho dodaného thyminového zbytku, který byl přenesen v podobě dideoxythymidin-trifosfátu (ddTTP), nebo přes dinukleotid s tímto thyminovým zbytkem.
CloneJET PCR Cloning Kit snižuje reakční dobu PCR klonování na pouhých 5 minut, zvyšuje účinnost reakce na více než 99 % a spojuje dvě různé molekuly DNA bez ohledu na ukončení neštěpených fragmentů (lepivé vs. tupé konce). V kitu je obsažen již připravený vektor pro klonování - pJET1.2/blunt s restrikčními místy a promotorem T7 pro in vitro i in vivo transkripci a případné sekvenování.
Druhý TA systém Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit v jednom kroku přímo klonuje PCR produkty zakončené 3'-dA přesahem. Děje se tak pomocí vektoru pTZ57R / T, který zajišťuje vysokou výnosnost klonování (více než 90 %).
Klonování s DNA ligací
Ligace neboli spojování dvou fragmentů DNA kovalentní vazbou, je v celém procesu klasického klonování in vitro stěžejním krokem. Při vazbě dochází ke vzniku fosfodiesterové vazby mezi 5´fosfátovou skupinou jednoho a 3´OH skupinou druhého řetězce, respektive fragmentu. Tuto důležitou reakci po katalytické stránce zajišťují enzymy z rodiny DNA ligáz. Nejčastěji užívaným enzymem, který se v buňce běžně účastní crossing-overu, replikace a opravy DNA, je T4 DNA ligáza získaná z buněk E. coli infikovaných fágem T4. Při samotné ligaci dochází ke spojování častěji lepivých konců a spotřebě energie dodané jednou molekulou ATP.
V laboratorních podmínkách se ligace provádí většinou za nižší teploty, než je teplota lidského těla, protože molekuly mají v takovém prostředí menší kinetickou energii. Pravděpodobnost nekomplementární vazby je pak redukována na minimum. Při rutinní teplotě 15-16 °C sice aktivita enzymu, efektivita i doba reakce není optimální, ale počet chyb při klonování je minimalizován a tedy nižší než v případě živých organismů při 37 °C, protože ty jsou schopny většinu chyb opravit. Disponují totiž, na rozdíl od experimentů in vitro, opravnými (reparačními) mechanismy k reparaci DNA.
I přes nízkou chybovost je však toto zpomalení techniky i nízký výtěžek nepříjemný faktor. Současný výzkum a nedávné pokroky nabízí nová řešení. Jedním z nich jsou kity (sady), v nichž je zahrnuta vysoce výkonná T4 DNA ligáza ve vhodném pufru a další komponenty urychlující některé reakce. Takovým je například Thermo Scientific Rapid DNA Ligation Kit s T4 DNA ligázou a speciálně připraveným pufrem, který je optimalizovaný právě pro rychlou a efektivní DNA ligaci nebo dále Rapid DNA Ligation Kit. Oba kity obsahují reakční komponenty pro ligaci fragmentů s tupými konci, při pokojové (laboratorní) teplotě a jen v 5 minutách. Všechny dodávané reagencie jsou již předem připraveny k pohodlnému a rychlému použití včetně činidla pro případnou opravu. Stačí jen přidat vlastní vyšetřované vzorky DNA a hotové reakční směsi lze přímo transformovat do bakterií.
Bakteriální transformace
Termín transformace je možné v genetice vyložit jako bezkontaktní přijetí cizorodé genetické informace určitým organismem, a právě to je zásadní odlišení od ostatních způsobů horizontálního přenosu genetického materiálu (konjugace, transdukce apod.). V přírodě transformace probíhá zejména přirozeně u bakterií, v laboratoři uměle in vitro v biotechnologiích genetického inženýrství. Mechanismus průniku DNA (do určité velikosti) spočívá v přichycení molekuly na buněčnou stěnu, průniku do cytoplazmy a zabudování cizorodé DNA do vlastní bakteriální dědičné informace, a to většinou způsobem crossing-over.
V České republice je v současné době nově k dostání Thermo Scientific TransformAid Bacterial Transformation Kit, který je díky speciálnímu roztoku T-solution unikátní svou vysokou účinností transformace více než 107 transformací na 1 µg plasmidové DNA, a protože i paleta použitelných bakteriálních kmenů je rozsáhlá a relativně dobrá je také doba kultivace, představuje tento kit při rutinních testech naprostý ideál.