Připravili jsme pro vás pracovní protokol a podrobný návod na použití systému Fast DNA End Repair Kit.
Hledaný výraz musí mít více jak 2 znaky.
Modifikace konců fragmentů DNA pro klonování systémem Fast DNA End Repair Kit
Fast DNA End Repair Kit je systém pro enzymatické zarovnání (otupení) a fosforylaci úseků DNA. Jejím výsledkem jsou tzv. tupé konce - komplementárně zakončené fragmenty DNA, které je možné následně spojit (ligovat) a využít například při klonování s využitím navazující řady kitů značky Thermofisher, kterou v České republice zastupuje naše společnost Biogen.
Obsah balení Fast DNA End Repair Kit
| Fast DNA End Repair Kit | Kód produktu K0771 |
| End Repair Enzyme Mix | 125 μl |
| 10X End Repair Reaction Mix | 250 ml |
Práce s kitem jde snadno, rychle a s minimálním pipetováním
End Repair Enzyme Mix obsahuje již optimalizovanou směs T4 DNA polymerázy a Klenowova fragmentu pro vysoce účinnou modifikaci koncových nukleotidů segmentů DNA a dále T4 kinázu pro jejich efektivní fosforylaci. 10X End Repair Reaction Mix zahrnuje reakční pufr, ATP a dNTPs, tedy veškeré složky pro PCR.
Ligace DNA molekul různého původu je vysoce účinná a přímá, bez nutnosti nákupu dalších chemikálií.
Optimální je používat kit pro vzorky genomické DNA o velikosti PCR produktů 100-2500 bp, s koncentrací alespoň 0.5-5 μg a objemu ≤ 42.5 μl. Komponenty v obou mixech jsou připraveny tak, aby bylo možné snadno a v krátké době vložit přímo amplifikovanou a štěpenou DNA (restrikční enzymy Fermentas) do linearizovaného vektoru ošetřeného stejným způsobem, respektive totožnou restriktázou. V kitu je zahrnuta rovněž T4 DNA ligáza (enzym katalyzující spojování – ligaci, konkrétně tvorbu fosfodiesterových vazeb mezi fragmenty cizorodé DNA) a speciálně optimalizovaný pufr (5X Rapid Ligation Buffer).
Využijte možnosti objednat i další navazující kity
Na našem eshopu, prostřednictvím kontaktního formuláře nebo telefonicky na čísle 241 401 693 můžete objednávat různé systémy obsahující jednotlivé vektory, do nichž lze vkládat DNA fragmenty s tupými nebo přesahujícími konci, či úseky bez ohledu na jejich zakončení.
- Nabízíme například ligace s využitím kitu Rapid DNA Ligation Kit, který umožňuje sjednotit PCR produkty, jak s přesahujícími, tak tupými konci, a vzniklou rekombinantní DNA transformovat do hostitelské buňky E. Coli (Transformaid), kde je rekombinantní vektor přímo namnožen. Výsledkem je velké množství identických klonů, jež jsou současně stejné s původní DNA. Vytvoření klonů je efektivní, rychlé a s dobrým výtěžkem i kvalitou.
- Tyto vlastnosti mohou být dále zlepšeny rozšířením použitých komerčních sad např. o TransformAid™ Bacterial Transformation Kit k přípravě kompetentních buněk. Aplikací kitu je příprava odpovídajících bakteriálních kolonií nesrovnatelně rychlejší a doba od amplifikace původní sekvence v místě s variabilitou (eventuálně s mutací nebo jinou numerickou či nukleotidovou aberací) až po transformaci je podstatně kratší.
Systémy této řady poskytují při reakci vysokou účinnost a taktéž jistý komfort při samotné analýze. Laboratorní práce je totiž díky nim precizní s validními výsledky. Kladem je taktéž jejich komplexita, což znamená, že jednotlivé komerčně dodávané sady na sebe navazují bez nutnosti nákupu dalších speciálních chemikálií.
Důležitá upozornění
- Veškeré komponenty pro daný krok celého procesu klonování jsou v konkrétních kitech obsaženy, všechny přípravky jsou zdraví nezávadné a šetrné k životnímu prostředí.
- Speciální chemikálie, jako například reakční pufry nebo vektory, byly navrženy a optimalizovány speciálně pro klonování DNA vzorků v bakteriálních buňkách E. Coli.
- Jejich specifikace byla potvrzena také experimentálně.
Gelovou purifikaci DNA vzorků vám usnadní systém GeneJET™ Gel Extraction Kit o objemu 50 nebo 250 preparací.
Kontrola kvality
Kontrola endo a exonukleáz byla provedena funkčním testováním a bylo dosaženo efektivity ≥95%, tj. očekávaného množství specifického PCR produktu.
Tento produkt byl navržen a vyvinut a je nyní dostupný výhradně pro výzkumné účely, a to pouze při použití in vitro. Produkt nebyl testován za účelem používání v diagnostice nebo pro vyvíjení léčiv. Není vhodný k vnitřnímu podávání. © 2012 Thermo Fisher Scientific Inc.