Přesné a reprodukovatelné kvantifikování transkriptů je klíčové při studiu genové exprese. Vědci vyvinuli dvě výkonné metody pro RNA sekvenování (RNA-Seq), které minimalizují bias a variabilitu: unikátní molekulární identifikátory (UMIs) a ERCC RNA spike-ins. V tomto článku vám představíme základy těchto nástrojů a ukážeme, jak vám mohou pomoci generovat kvalitnější RNA-Seq data.
Unikátní molekulární identifikátory (UMIs)
Co jsou UMIs?
UMIs jsou krátké, náhodné nukleotidové sekvence přidané k jednotlivým transkriptům během přípravy knihovny. Obvykle mají délku 8 až 12 nukleotidů a fungují jako molekulární čárové kódy, které jednoznačně identifikují cDNA molekulu. Na rozdíl od indexových sekvencí, které jsou stejné pro všechny molekuly ve vzorku, jsou UMIs jedinečné pro každou molekulu.
Proč se UMIs používají?
Při přípravě knihovny se často používá PCR amplifikace ke zvýšení počtu nízko zastoupených transkriptů ve vzorku, což zvyšuje šanci, že budou přečteny během sekvenování. PCR však není dokonalé – může být zaujaté, protože některé molekuly se amplifikují efektivněji než jiné, a může také zavádět chyby nebo mutace při kopírování. Výsledkem je, že sekvenační data nemusí přesně odrážet původní populaci RNA molekul.
UMIs pomáhají korigovat bias a chyby způsobené PCR amplifikací. Označením původní cDNA molekuly UMI kódem budou všechny její PCR kopie nést stejný čárový kód. Po sekvenování bioinformatické nástroje identifikují PCR duplikáty a odstraní je z datového souboru. Chyby způsobené PCR a sekvenováním lze také identifikovat a opravit porovnáním sekvencí všech čtení se stejným UMI. Vyčištěná data jsou pak připravena k analýze genové exprese.
Kdy by se měly UMIs používat?
UMIs se používají při hlubokém sekvenování (>50 milionů čtení/vzorek) a při analýze RNA vzorků s nízkým vstupem, protože tyto scénáře mají největší pravděpodobnost výskytu PCR duplikátů.
ERCC RNA
Co je ERCC RNA?
ERCC znamená External RNA Controls Consortium. Jedná se o skupinu vědců a organizací, která vyvinula sadu syntetických RNA molekul pro standardizaci kvantifikace RNA při profilování genové exprese. ERCC spike-in mix obsahuje 92 transkriptů známé koncentrace, rozdělených do čtyř podskupin, z nichž každá obsahuje 23 kontrol pokrývajících šest logaritmických řádů dynamického rozsahu koncentrace. ERCC mix se přidává do RNA vzorku na začátku přípravy knihovny.
Proč se ERCC RNA používá?
Použití ERCC spike-ins pomáhá standardizovat kvantifikaci RNA napříč různými experimenty. Pomocí počtu čtení ERCC kontrol mohou vědci určit citlivost (tj. limit detekce), dynamický rozsah, linearitu a přesnost RNA-Seq experimentu. Mohou také kontrolovat technické variace mezi jednotlivými běhy.
Kdy by se měla ERCC RNA používat?
ERCC RNA se používá k porovnání technického výkonu běhů napříč více experimenty.
Závěr
RNA-Seq je široce používaná metoda pro analýzu genové exprese, ale cesta od purifikované RNA k počtu čtení je náchylná k biasu, sekvenačním chybám a variabilitě. Naštěstí použití UMIs a ERCC RNA může tato rizika zmírnit a generovat přesnější výsledky.
Jste připraveni generovat vysoce kvalitní RNA-Seq data hned napoprvé?
Zvažte přidání UMIs a ERCC RNA do svého RNA-Seq experimentu s GENEWIZ, abyste snížili technickou variabilitu a zvýšili spolehlivost svých dat.
Kategorie
Tento blog je zařazen do následujících kategorií:
Mohlo by vás také zajímat
- Můžete si přečíst: Řešení problémů s DNA šablonami při Sangerově sekvenování
- připravujeme: Zajistěte kompletní validaci plazmidu na první pokus pomocí Oxford Nanopore sekvenování
- připravujeme: Síla proteomiky
Sledujte nás
💬 Máte dotazy? Kontaktujte nás!
- Podpora: biogen@biogen.cz
- Objednávky: biogen@biogen.cz