Upravit stránku

MLPA kity Multiplex Ligation Probe Amplification

Multiplex Ligation Probe Amplification

Metoda je založena na ligaci dvou sond a následující amplifikaci. Sondy jsou sestaveny tak, že k sobě přiléhají a nasednou-li na komplementární sekvenci (rozhodující je nukleotid na 3´ konci první sondy v místě dotyku s druhou sondou), může dojít k amplifikaci. Koncové části sond slouží jako priméry. Pro různé páry sond je ještě do nich vložena identifikační sekvence, která je umožní identifikovat a tak současně testovat velké množství různých míst v genomu.

Metoda vyžaduje velmi malá množství templátu – 20ng DNA, která může být i částečně degradovaná (parafinové bločky, formalinem ošetřené tkáně, fetální DNA v mateřské plasmě). Je vhodná pro stanovení SNP genotypů a testování metylací v promotorové oblasti genů.

MPLA

Výhody MLPA®

MLPA® pro detekci počtu kopií nabízí mnoho výhod oproti jiným technikám. Za prvé, metody, které byly primárně vyvinuty pro detekci bodových mutací, jako je sekvenace a DHPLC, zpravidla
přehlédnou změny v počtu kopií. Metoda Southern blotu odhalí mnohé aberace, ale ne vždy dokáže
detekovat malé delece a není ideální pro rutinní zpracovávání velkého množství vzorků. I když
charakterizovat delece a amplifikace dovede dobře PCR, určení míst zlomů obvykle nezvládne.

Navíc, při srovnání MLPA a FISH, MLPA® má nejen tu výhodu, že jde o multiplexovou techniku, ale také to, že je cílená na velmi malé (50-70 nt) sekvence, což umožňuje detekci i jednonukleotidových aberací, které jsou příliš malé pro zachycení FISH metodou. Navíc lze MLPA® použít na čištěnou DNA. A konečně, v porovnání s arrayCGH, je výhodou MLPA® nízká cena a technická jednoduchost. Přestože MLPA® není vhodná pro celogenomový screening, je dobrou alternativou pro mnoho běžných aplikací.

Více než 300 sad sond, které jsou nyní komerčně dostupné a jsou určeny k použití v rozsahu od relativně častých (Duchenne, DiGeorge syndrom, SMA), i pro velmi vzácná onemocnění (hereditární pankreatitida, nedostatek antitrombinu, Birt-Hogg-Dubé syndrom).

Schéma MLPA® reakce

  1. Denaturace
  2. Hybridizace
  1. Legace
  2. PCR

Představujeme vám nové kity SALSA MLPA

Tento kit byl aktualizován v červenci 2013 a obsahoval další sondu lokalizovanou 145 nt před exonem 3, což usnadnilo detekci počtu kopií tohoto exonu a zároveň byla vyloučena velká delece intronu 2 pravděpodobně zasahující do exonu 3 (u některých pacientů byla detekována delece intronu 2 o neznámé velikosti pomocí předchozí verze kitu). Navíc byla přidána jedna hraniční sonda pro PTEN a několik referenčních sond bylo nahrazeno jinými.

Kity ve vývoji

Jak firma MRC - Holland zmínila ve svém červencovém bulletinu, pracuje na nové verzi kitu P002 BRCA1. Testovací kit této nové verze je nyní k dispozici. Pokud ho máte zájem otestovat, prosím, kontaktujte info@mlpa.com . Aktuální verze bude k dispozici nejpozději do léta roku 2014.

V nové verzi kitu je zahrnuto dalších dvanáct BRCA1 sond, což vede k lepšímu pokrytí dlouhého exonu 11. V kitu jsou dále sondy pro exony 13, 16, 24 a pro oblast promotoru. Ligační místa současných BRCA1 sond zůstaly beze změny s výjimkou jedné sondy pro exon 24.

Stejně jako u kitu P002 BRCA1, připravuje firma v současné době nové verze kitů P045 a P090 BRCA2. V nových kitech P045 a P090 budou zahrnuty další sondy pro dlouhé exony v genu BRCA2. Většina sond přítomných v současných verzích kitů P045 a P090 zůstane stejná, ale lepší pochopení vlivu variability DNA na průběh MLPA nás vedlo k nahrazení některých sond. Dalším zlepšením v nové verzi je zahrnutí sondy, která je schopná detekovat wild-type (původní typ) sekvenci pro mutaci c.156_157insAlu v exonu 3, která může být snadno přehlédnuta při použití běžných skríningových metod jako je Sanger sekvenování .

V předešlých měsících několik našich zákazníků testovalo novou verzi kitu P140 HBA (verze C1). Tato nová verze nahradí současnou verzi přibližně v dubnu. Současná verze bude k dispozici na vyžádání minimálně do léta 2014.

Při použití aktuální verze B4 je někdy obtížné rozlišit malé delece způsobené genovou konverzí, neboť pouze jedna sekvence z dvojice blízce příbuzných sekvencí je detekována sondou. Do nového kitu P140 jsme zařadili pět párů sond, které detekují počet kopií obou těchto blízce příbuzných sekvencí v oblasti HBA1/HBA2. Dále jsou v kitu tři sondy detekující sekvence identické v HBA1 a HBA2 , a proto u většiny jedinců detekují čtyři kopie na buňku. V kitu je ještě 5 sond překrývajících centromerickou oblast HBA. Podrobnější popis nového kitu P140 je k dispozici na vyžádání.

Zárodečné mutace v genech GATA2,TERC,TERT, CEBPA a RUNX1 byly prokázány, že jsou asociovány s familiární MDS - AML. Tento kit obsahuje alespoň jednu sondu pro každý exon z těchto výše uvedených genů a také dvě specifické sondy pro mutace GATA2 R398W a T354M, které jsou běžně nalézány u pacientů s MonoMAC .

  • X056 Folikulární lymfom
  • Kit SALSA MLPA X056 - A1 Folikulární lymfom obsahuje 44 sond pro detekci ztráty 1p (TNFRSF14), 6q (EPHA7), 9p (CDKN2A/2B ) a 17p (TP53) a zisk 1q, 3q (BCL6), 6p, 7q (EZH2), 8q (MYC), 12q a 18q (BCL2). Kromě toho také obsahuje dvě specifické sondy pro mutace EZH2 Y646F (c.1937A > T) a EZH2 Y646N (c.1936T > A).
  • X057 Difuzní velkobuněčný B - lymfom

Kit SALSA MLPA X057 - A1 DLBCL obsahuje sondy pro následující oblasti: 2p (REL, PUS10), 3p (FOXP1), 3q (NFKBIZ, BCL6 ), 6q (PRDM1, TNFAIP3), 9p (JAK2, PDCD1LG2, CDKN2A / B), 10q (PTEN), 12q (MDM2), 13q (MIR17HG, ING1), 17p (TP53), 18q (BCL2 , NFATC1), 19q (SPIB). Dále kit obsahuje specifickou sondu pro jednu mutaci v genu MyD88 (c.794T > C, L265P).

  • X060 MDS - AML

Při stanovení specifických subtypů a prognózy u myelodysplastického syndromu (MDS) a akutní myeloidní leukémie (AML) vedle morfologického a cytochemického vyšetření hraje důležitou roli také molekulárně genetická analýza. Kit X060 - A1 MDS-AML obsahuje 40 sond pro 12 chromozomálních oblastí, ve kterých dochází ke změnám počtu kopií u pacientů s MDS a AML, jako například: 4q (TET2), 5q (CTNNA1, NPM1), 6p (JARID2), 7p (IKZF1) a 7q (CUX1, MLL5, EZH2), 11q (ATM, MLL - sondy se nachází v oblasti PTD), 12p (ETV6, AEBP2), 17p (TP53) a 17q (NF1, SUZ12), 20q (ASXL1), 21q (RUNX1, U2AF1). Tento kit také detekuje 8 somatických mutací opakovaně vyskytujících se u těchto myeloidních malignit: DNMT3A (R882H), IDH1 (R132H a R132C), IDH2 (R140Q), SF3B1 (K700E), FLT3 (D835Y), NPM1 (W288fs * 12) a ASXL1 (G646fs * 12).


Důležité informace pro uživatele programu Coffalyser

Díky vydání nové verze programu Coffalyse, zvaného Coffalyser.Net, může dojít k několika důležitým změnám u zákazníků, kteří využívají Coffalyser fungující v rámci aplikace Excel.

  • Coffalyser.Net

Excel - Coffalyser byl jeden z našich dřívějších produktů, kterým jsme se snažili nabídnout větší podporu pro analýzu MLPA dat. Od té doby jsme pokračovali v rozvoji programu Coffalyser. Jsme rádi, že nyní Vám můžeme nabídnout Coffalyser.Net, který je komplexní, je snadno ovladatelný pro uživatele a nabízí robustní analýzy MLPA. Coffalyser.Net byl poprvé uveden jako zkušební verze v roce 2011 a od té doby byl dále rozvíjen. V roce 2013 byl k dispozici pro všechny uživatele MLPA. Od té doby Coffalyser.Net prošel pouze menšími změnami.

  • Podpora pro Excel - Coffalyser

Jelikož věříme, že Coffalyser.Net nabízí lepší analýzu než Excel - Coffalyser, rádi bychom tuto verzi fungující v rámci aplikace Excel vyřadili z používání. Podporu pro Excel - Coffalyser budeme nabízet do 15. dubna 2014, abychom umožnili všem uživatelům této verze přejít na Coffalyser.Net.

  • Podpora přechodu na Coffalyser.Net

Coffalyser.Net lze snadno nalézt na naší webové stránce www.mlpa.com, kde si můžete po registraci program stáhnout zdarma. Odkazy na další související materiály jsou zde také uvedeny. Pro nové uživatele Coffalyser.Net doporučujeme Coffalyser Wordpress s informacemi o programu: http://coffalyser.wordpress.com .

Nahoru